MPB：中科院王光华组土壤和水体环境T4型细菌病毒g23基因多样性研究
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(pMD18-T，TaKaRa，Dalian，China，catalog number: D101A)14.DNase和RNase酶 (全式金生物科技有限公司)15.蛋白酶K (全式金生物科技有限公司)16.CTAB/NaCl (见溶液配方)17.Na2EDTA18.氯仿19.异戊醇20.苯酚21.Acetate22.Tris23.Acrylamide24.Bis-Acrylamide (N,N’-methylene-bis- Acrylamide)25.SDS26.Formamide27.Urea28.TE缓冲液 (见溶液配方)29.PCI (见溶液配方)30.CIA (见溶液配方)31.TE saturated phenol (见溶液配方)32.50× TAE (见溶液配方)33.10% SDS缓冲液 (见溶液配方)34.40% (w/w) 丙烯酰胺 (见溶液配方)35.DGGE凝胶 (见溶液配方)仪器设备1.高压灭菌锅(BKQ-B50Ⅱ)2.烘箱(AHS-562)3.Eppendorf移液器 (100μl和1000μl)4.0.45 μm、0.2 μm和0.02 μm微孔滤膜 (Lablead)5.DGW-80微型离心机 (TGL-16G-A)6.Fast Prep®-24振荡器7.可见紫外分光光度计 (TECHOMP UV7500)8.DYY-CC型电泳仪9.PCR仪 (GeneAmp PCR system 9700，Applied Biosystem)10.变形梯度凝胶电泳仪 (BIO-RAD)11.显影仪 (BIO-RAD)12.Nanodrop 2000 (Thermo)13.超纯水制备仪 (Milli-Q Advantage)14.超净工作台 (DL-CJ-N)15.数显恒温水浴锅 (W-201B)16.B-100自动颗粒制冰机 (太华)实验步骤一、土壤DNA提取采用土壤总DNA进行相关噬菌体标记基因研究，总DNA提取使用Fast DNA® SPIN Kit for Soil试剂盒，操作步骤如下：1.取0.5 g新鲜土壤于 (Lysing Matrix E tube) 配套的小管中，加入978 μl Phosphate buffer，再加入122 μl MT buffer，在Fast Prep®-24振荡器6.0, 震荡45 s。2.14,000 × g离心15 min小心吸取上清液。3.上清液转移到无菌的2.0 ml离心管中，加入250 μl PPS缓冲液，用手轻摇10次。4.14,000 × g离心5 min，将上清液转移到2.0 ml离心管中(15 ml离心管可以增加DNA的提取效率)，加入1 ml Binding Matrix 用手上下摇动2 min后室温静止3 min。5.小心移去500 μl上清液后将溶液混匀，小心吸取600 μl溶液到SPIN Filter中14,000 × g离心1 min，将接替管中的残液倒掉。重复此操作步骤(2-3次)，直至全部溶液完成离心步骤。6.向离心管中加入500 μl SEWS-M 并用冲力将沉淀物冲洗几遍，14,000 × g离心1 min，将接替管(Catch tube)中的残液倒掉。7.14,000 × g离心2 min，将原接替管(Catch tube)及其残液去除，更换新的接替管(Catch tube)后，将SPIN Filter在室温条件静止5 min后加入50 μl DES 保存于-20 °C备用。二、水体DNA提取1.取300 ml水样，在10,000 × g、4 °C条件下离心10 min，以除去土壤颗粒、浮游生物等。2.上清液分别过0.45 μm和0.2 μm的微孔滤膜，以去除病毒颗粒以外的微生物。病毒颗粒然后采用减压过滤的方式收集到0.02 μm的滤膜上。3.将滤膜放在灭菌的2 ml离心管中，加入700 μl 10mM Tris-HCl (pH，7.5) 获得病毒浓缩液。4.向离心管中加入DNase和RNase酶溶液分别达到浓度10 μg ml-1后，病毒浓缩液在37 °C水浴条件下培养4~5 h，以消解游离的寄主DNA和RNA。采用细菌的通用引物对消解后的病毒浓缩液进行PCR检测，验证游离的胞外遗传物质是否去除干净。5.再向离心管中分别加入38 μl的10% SDS，7.5 μl的1M Tris-HCl，15 μl的0.5 M EDTA和2 μl的蛋白酶K (10 mg ml-1)。6.混匀后在55 °C条件下水浴30 min，然后再加入140 μl的5 M NaCl和150 μl的CTAB/NaCl溶液，再在65 °C水浴10 min。7.病毒DNA采用PCI溶液和CIA溶液萃取，萃取的水相加入体积0.6倍的Isopropanol溶液1,8000 × g、4 °C条件下离心20 min，DNA沉淀经70%乙醇洗净后，干燥、溶于TE buffer中。三、PCR引物上述提取的土壤或水体DNA，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000对DNA质量进行检测，合格的DNA采用简并引物MZIA1bis (5'-GAT ATT TGI GGI GTT CAG CCI ATG A-3')和MZIA6 (5'-CGC GGT TGA TTT CCA GCA TGA TTT C-3') (Filée等，2005)扩增g23基因片段。四、PCR扩增体系及步骤PCR反应体系按照50 μl为例：Ex-Taq Buffer5 μldNTP (2.5 mM)5 μlPrimer F (10 mM)2 μlPrimer R (10 mM)2 μl模板DNA (100 ng/μl)2 μlEx-Taq polymerse (TaKaRa) DNA聚合酶1 μl无菌水33 μlPCR反应程序 (35循环)：Step 1: 94 °C5 min预变性Step 2: 94 °C1 min变性Step 3: 55 °C1 min退火Step 4: 72 °C1 min延伸Step 5: go to Steps 2~435个循环循环扩增Step 6: 72 °C10 min充分延伸五、PCR产物纯化利用1.5%琼脂糖凝胶进行PCR产物电泳检测，参照DNA Marker条带的分子量大小，初步判断扩增条带是否是g23基因片段。根据笔者经验，不同环境样本中g23基因片段大小在350~600 bp之间。将目的片段位置合格的样本，用无菌手术刀切取目的条带，参照胶回收试剂盒的操作说明进行基因片段的纯化，用NanoDrop 2000测定产物浓度后，进行下游实验。六、克隆、变形梯度凝胶电泳 (DGGE)及测序将纯化后的产物连接到质粒pMD18-T (TaKaRa，Dalian，China)上，导入大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞中，将阳性克隆PCR扩增后，通过DGGE筛选单一条带的方法，去掉重复序列，将单一的克隆产物进行Sanger测序分析。1.PCR产物克隆1.1克隆反应体系 (以pMD18-T载体为例)：pMD18-T Vector (TaKaRa) 1 μlDNA 1 μl超纯水 3 μlSolution I 5 μl终体积 10 μl1.216 °C恒温反应30 min。1.3取100 μl大肠杆菌感受态加入到步骤1.1中的反应体系，冰浴30 min。1.442 °C水浴45 s，再冰浴1 min。1.5加入890 μl的SOC溶液，37 °C摇床培养1 h。1.6转入到含抗生素 (IPTG、AMP、X-Gal) 的LB平板上，37 °C培养14~16 h。1.7挑取白斑进行PCR检测。2.DGGE筛选单一条带后测序将挑选的阳性克隆样品作为模板，用引物MZIA1bis-MZIA6进行PCR扩增，扩增条件同步骤四，扩增循环数降到25个。筛选扩增成功的PCR产物进行DGGE分析 (变性剂浓度为20%~80%)，电泳条件为150 V、60 °C、泳动15 h。电泳结束后，筛选DGGE图谱中不同条带位置所对应的阳性克隆，摇菌扩繁后进行Sanger测序 (Liu等，2011)。注意事项1.本研究是以T4型细菌病毒g23为例，介绍了环境噬菌体多样性的研究方法。读者根据实验目的，采用相同的研究方法，可对环境噬菌体的其他标记基因作为研究对象，如噬菌体的psbA、psbD (Zeidner等，2003)及蓝藻噬菌体的g20 (Jameson 等，2011), DNA pol (Breitbart等，2004)和phoH (Goldsmith等，2015) 等基因。其他标记基因的PCR反应体系及扩增条件请参照上述文献报道。2.关于PCR反应。由于T4型细菌病毒DNA只占提取土壤微生物总DNA的很小一部分，所以土壤总DNA纯度高低直接影响PCR效果。对于没有无法获得PCR产物的样品DNA，可通过DNA纯化或调整模板用量的方法予以解决 (王光华等，2011)。此外，为减低土壤腐殖酸等干扰物对PCR扩增的干扰，每50 μl体系可添加0.5μl BSA来提高PCR扩增效率。3.关于PCR产物。引物MZIA1Bis和MZIA6是简并引物，专一性不强。环境中g23基因被扩增出来的同时，一些非g23基因的其它DNA片段也可能被扩增出来。剔除这些非g23基因的方法，可采用看是否可以翻译成氨基酸序列，以及氨基酸序列通过GenBank上的BLASTp比对看是否是T4型细菌病毒g23家族的基因来解决。4.关于扩增的g23基因片段大小。g23是编码T4型细菌病毒头部主要壳蛋白的结构基因。细菌病毒不同，则g23基因长度也有差异，g23基因编码氨基酸长度与病毒颗粒头部大小有一定的关系。目前的研究结果表明，引物MZIA1Bis和MZIA6扩增的g23基因片段长度相差很大，编码的氨基酸 (未含引物部分) 最长的可达到198个，最短的为103个，但绝大部分集中在120~150个氨基酸之间。根据笔者的经验，PCR产物小于300 bp和大于700 bp的扩增产物均不是g23基因，可以在后续研究中不予考虑。5.研究中涉及含水量较大，如湿地和稻田环境土壤，提取DNA前需要对新鲜土壤样本进行冷冻干燥，降低其含水量。此外，为增加水体DNA的提取效率，可将300 ml水体过滤样本增加到500~1,000 ml。溶液配方1.TE缓冲液1 M (pH = 8.0) 1 ml0.5 M Na2EDTA 0.2 ml终体积 100 ml2.PCITE saturated phenol (TE饱和酚溶液) 100 ml氯仿 (Chloroform) 96 ml异戊醇 (Isoamylalcohol) 4 mlTE buffer 100 ml4 °C保存3.CIA氯仿 (Chloroform) 96 ml异戊醇 (Isoamylalcohol) 4 ml室温保存4.TE saturated phenol称500 g苯酚溶在水中，60 °C水浴，称1 g 8-quinolinol分装2个烧瓶，各加200 ml 1 mol/L Trish (pH = 0.8)，混匀，去掉上层，各加200 ml TE buffer，4 °C保存。5.50× TAETris 242 gAcetate 57.1 gNa2EDTA 7.43 g终体积1,000 ml6.40% (w/w)丙烯酰胺 (Acrylamide)Acrylamide 38.93 gBis-Acrylamide (N,N’-methylene-bis- Acrylamide) 1.07 g终体积 100 ml4 °C保存7.10% SDSSDS 10 g超纯水 90 ml终体积 100 mlpH 7.2室温保存8.CTAB/NaClCTAB 10 gNaCl 4.1 g超纯水 80 ml终体积 100 ml9.DGGE凝胶变性梯度A：20%Denaturing solutionB：80%Denaturing solution40% Acrylamide/Bis50× TAEFormamideUreaMilliQW3.2 ml0.32 ml1.28 ml1.35 g定容到16 ml3.2 ml0.32 ml5.12 ml5.4 g定容到16 ml参考文献1.王光华，刘俊杰，Makoto Kimura. (2011). 自然环境中T4型噬菌体g23基因多样性研究进展. 微生物学报 51(6) : 732-739.2.王光华，刘俊杰，朱冬，叶茂，朱永官. (2020). 土壤病毒的研究进展与挑战. 土壤学报3.Breitbart, M., Miyake, J. H. and Rohwer, F. (2004). Global distribution of nearly identical phage-encoded DNA sequences. FEMS Microbiol Lett 236(2): 249-256.4.Filée, J., Tétart, F., Suttle, C. A. and Krisch, H. M. (2005). Marine T4 type bacteriophages a ubiquitous component of the dark matter of the biosphere. Proc Natl Acad Sci USA 102(35): 12471-12476.5.Goldsmith, D. B., Parsons, R. J. and Beyene, D. (2015). Deep sequencing of the viral phoH gene reveals temporal variation, depth-specific composition, and persistent dominance of the same viral phoH genes in the Sargasso Sea. Peer J 3: e997.6.Jameson, E., Mann, N. H., Joint, I., Sambles, C. and Muehling, M. (2011). The diversity of cyanomyovirus populations along a North-South Atlantic Ocean transect. Isme J 5(11): 1713-1721.7.Liu, J. J., Wang, G. H., Zheng, C. Y., Yuan, X. H., Jian, Jin. and Liu, X. B. (2011). 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