基于网络药理学和分子对接技术探讨“半枝莲–山慈菇”抗乳腺癌的作用机制
摘 要：目的 通过网络药理学和分子对接方法探讨“半枝莲–山慈菇”抗乳腺癌的作用机制。方法 通过中药系统药理学分析平台（TCMSP）筛选半枝莲、山慈菇的有效化学成分及相应靶蛋白。通过DrugBank、Uniprot数据库筛选乳腺癌潜在靶点，运用Cytoscape 3.8.0软件构建“化合物–靶点–疾病”网络图。使用STRING数据库绘制蛋白互作（PPI）网络，利用DAVID数据库对有效作用靶点进行GO功能、KEGG通路富集分析。结果 共筛选出半枝莲中有效化学成分29个，山慈菇中有效化学成分3个；对应潜在作用靶点517个，乳腺癌靶点118个；将“半枝莲–山慈菇”与乳腺癌的靶点对比，获得8个药物–疾病共同靶点，包括雄激素受体（AR）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（CASP3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（CASP9）、雌激素受体α（ESR1）、雌激素受体β（ESR2）、钾电压门控通道亚家族H成员2（KCNH2）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）和钠依赖性血清素转运体（SLC6A4）。GO功能分析得到197个条目，涉及药物代谢等方面。KEGG通路分析得到116个条目，涉及膀胱癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、非洲锥虫病、前列腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌等通路。结论 研究揭示了“半枝莲–山慈菇”抗乳腺癌的关键靶点和涉及的生物学过程及信号通路，并结合分子对接技术，发现其作用是多靶点、多通路的，为今后的分子生物学实验奠定了基础。
乳腺癌是威胁女性生命和健康的常见疾病之一，据全球癌症统计报告显示，乳腺癌在全球新发病例中位居第2，是最常见的女性恶性肿瘤，且发病率仍在上升[1]。目前乳腺癌的预防和治疗是以西医为主的综合治疗，手术、放疗、化疗、内分泌治疗、分子靶向治疗等为主要治疗手段。随着中西医结合不断深入，在中医整体观念指导下辨证施治可减少乳腺癌术后复发或转移，减轻放化疗副作用，减轻乳腺癌内分泌治疗的激素副作用，在三阴乳腺癌、晚期乳腺癌支持减症治疗等方面，充分发挥传统中医药的优势[2]。已有研究证实了半枝莲、山慈菇在单独治疗乳腺癌方面的效果[3-5]。半枝莲联合山慈菇治疗乳腺癌是否有效有待研究证实。
网络药理学通过化学信息学、生物信息学以及高通量数据分析构建“药物–靶标–疾病”关系网，已成为系统揭示药物与疾病之间复杂网络关系的综合工具[6-7]。近年来，网络药理学广泛应用于中医药领域，为研究中药潜在药理作用和阐明其复杂分子机制提供了指导。本研究通过使用网络药理学，靶向中药、疾病数据库并通过生物学分析方法以及分子对接技术探索“半枝莲–山慈菇”对乳腺癌的潜在作用机制，为进一步探究治疗乳腺癌提供理论依据和研究思路。
1 资料与方法
1.1 活性成分的获取与筛选
在中药系统药理学数据库（TCMSP，http://lsp. nwu.edu.cn/tcm-spsearch.php）[8]中，以“半枝莲”“山慈菇”为关键词在数据库中进行检索，获得半枝莲、山慈菇的化学成分，根据吸收、分布、代谢、排泄（ADME）参数，以类药性（DL）≥0.18、生物口服利用度（OB）≥30%为标准，并结合相关文献报道，获取半枝莲、山慈菇的活性成分。
1.2 主要作用靶点和乳腺癌疾病靶点的收集
通过TCMSP平台查询半枝莲、山慈菇活性成分的靶点信息，将靶点分别输入Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/），限定物种来源为人类，查询靶点蛋白的基因名。以“breast cancer”为检索词检索Drugbank数据库（https://www.drugbank.ca），获得乳腺癌相关靶点。
1.3 “成分–靶点”网络构建
“半枝莲–山慈菇”的“成分–靶点”网络通过Cytoscape 3.8.0进行构建和分析。将上述获得活性成分及靶点关系进行导入以完成相关网络构建，图中以节点（node）表示药物分子和相应基因，用边（edge）表示两者之间关系。
1.4 蛋白质相互作用网络（PPI）与核心靶点
将“半枝莲–山慈菇”的主要活性成份、靶点通过STRING数据库（Search Tool for the RetrievalofInteracting Genes/Proteins，https://string-db.org/）构建靶标PPI网络。
1.5 基因富集分析
为探寻核心靶点所涉及的基因功能和信号通路，采用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）平台对核心靶点靶点进行分析。设置物种为人，进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。
1.6 分子对接
活性化合物利用TCMSP寻找3D结构并使其能量最小，保存其mol2格式。通过PDB数据库（http://www.rcsb.org/）下载药物疾病的共同靶点的PDB格式。利用Pymol软件对受体进行去溶剂、去水等操作。利用Auto dock运行分子对接，并使用LIGPLOT查看或分析对接数据时会自动生成一个蛋白质–配体二维图，附有负责受体配体间相互作用的原子距离以及相应作用类型。
2 结果
2.1 活性成分与作用靶点
通过TCMSP检索得到“半枝莲–山慈菇”中有效活性成分共112种，其中半枝莲中有效化学成分94种，山慈菇中有效化学成分18种。以OB≥30%、DL≥0.18筛选出化学成分总计32种，其中半枝莲化学成分29种，山慈菇化学成分3种，删除重复成分等靶点，最终总计有效化学成分23种，见表1。
检索到的23种有效活性成分共对应518个作用靶点，删除重复靶点后剩余211个作用靶点，主要作用靶点包括前列腺素内过氧化物合酶1（PTGS1）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、核受体辅激活蛋白2（NCOA2）、胰蛋白酶1（PRSS1）、二肽基肽酶-4（DPP4）、热休克蛋白hsp90β（HSP90AB1）。
2.2 活性成分与靶点的网络构建
利用Cytoscape 3.8.0软件，导入半枝莲、山慈菇活性成分及靶点，进行网络绘制，见图1，该网络图直观地反映了这些成分与靶标的相互作用。如图1所示，共有233个节点，538条边，代表“半枝莲–山慈菇”有效成分与靶点、药物之间的对应关系。其中八边形代表山慈菇和半枝莲中有效成分，正方形代表潜在作用靶点，节点分别表示药物、成分和靶点蛋白，边代表三者之间的对应关系，图形大小与对应关系呈正比。
2.3 治疗乳腺癌的潜在作用靶点
将“半枝莲–山慈菇”的潜在靶点和通过Drugbank数据库检索的乳腺癌潜在靶点通过Venny平台进行映射取交集得到8个交叉靶点，见图2（包含2个游离靶点KCNH2和SLC6A4）。将获得的8个药物–疾病共同靶点上传至STRING在线数据库平台得到PPI网络即“半枝莲–山慈菇”在治疗乳腺癌的潜在作用靶点，见图3。“半枝莲–山慈菇”治疗乳腺癌的药理作用或许是通过这些靶点相互作用而得以发挥。
2.4 靶点GO富集和KEGG通路分析
通过将“半枝莲–山慈菇”中潜在的8个潜在靶点上传至在DAVID据库进行富集分析，共富集得到“半枝莲–山慈菇”中获得GO生物学过程197条，其中生物过程（BP）30条、细胞组成（CC）35条、分子功能（MF）132条，各自取前20列表。图4～6列出了潜在靶点的GO富集部分结果。
其中在BP层面，预测靶点主要参与正调控发热（positive regulation of fever generation）、腺苷酸环化酶抑制G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路（adenylatecyclase-inhibiting G-protein couple dacetylcholine receptor signaling pathway）、磷脂酶C活化G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路（phospho-lipase C-activating G-protein coupled acetylcholine receptorsignaling pathway）等生物过程具有显著意义；在CC层面，Bcl-2家族蛋白复合物（Bcl-2 family protein complex）、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物（cyclin-dependentprotein kinase holoenzyme complex）其所占比例较大；在MF层面，与BH3结构域结合（BH3 domain binding）、α1-肾上腺素能受体活性（alpha1-adrenergic receptor activity）、雄激素受体活性（androgen receptor activity）、前列腺素内过氧化物合酶活性（prostaglandin-endoperoxide synthase activity）等关系密切。
共富集得到“半枝莲–山慈菇”中获得KEGG生物学过程116条，取前20列表。图7列出了潜在靶点的KEGG富集部分结果。KEGG信号通路筛选得到前20条信号通路，涉及膀胱癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、非洲锥虫病、前列腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌等通路。
2.5 活性成分与蛋白分子对接结果分析
选取“半枝莲–山慈菇”通过网络药理学筛选出来的化学成分与蛋白分子对接，“半枝莲–山慈菇”的有效成分包括柚皮素、粗毛豚草素、4’-羟基汉黄芩素、β-谷甾醇、黄芩素、维生素B12、雷诺嗪、圣草酚、木犀草素、麝香草黄酮、槲皮素、豆甾醇等；蛋白分子为关键靶点PPI中筛选的蛋白分子，包括雄激素受体（AR）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（CASP3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（CASP9）、雌激素受体α（ESR1）、雌激素受体β（ESR2）、钾电压门控通道亚家族H成员2（KCNH2）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）和钠依赖性血清素转运体（SLC6A4），其部分对接结果见表2。
对接结果三维图及LIGPLOT分析见图8。从对接结果来看，排名前5的活性成分中有槲皮素、圣草酚、黄芩素、豆甾醇具有抗炎、抗氧化、抗癌以及抑制血小板凝结作用，可见“半枝莲–山慈菇”是通过多途径、多靶点作用于机体。
3 讨论
本研究通过网络药理学方法，筛选得到“半枝莲–山慈菇”有效成分23个，对应的有效成分作用靶点211个，与乳腺癌靶点取交集，得到8个共同作用靶点。“半枝莲–山慈菇”的有效成分包括柚皮素、粗毛豚草素、β-谷甾醇、黄芩素、维生素B12、雷诺嗪、圣草酚、木犀草素、麝香草黄酮、槲皮素、豆甾醇等，这些筛选出来的候选化合物与现有的药理学研究结果基本相符，说明该研究结果具有可参考价值。
槲皮素通过多种途径发挥抗癌作用。魏玮等[9]发现槲皮素可抑制宫颈癌细胞生长，导致宫颈癌植瘤瘤体内血管内皮细胞超微结构的改变，这可能与降低乙酰肝素酶蛋白表达有关。邓守恒等[10]发现槲皮素可通过阻滞宫颈癌HeLa细胞周期于G2/M期，下调Bcl-2/Bax来诱导细胞发生凋亡并增强其对放射线的敏感性。在人乳腺癌细胞系MCF-7细胞中，槲皮素治疗后的细胞凋亡显著增加[11]。
圣草酚可通过清除自由基减少生物大分子损伤，有良好的抗氧化活性。圣草酚还可以通过ROS介导的线粒体途径诱导细胞凋亡[12]。Lee等[13]发现转录激活因子1（ATF1）是RSK2的一种新底物，RSK2-ATF1信号通路在EGF诱导的肿瘤细胞转化中起重要作用。圣草酚可抑制RSK2介导的ATF1反式激活和EGF诱导的小鼠上皮细胞JB6Cl41向癌细胞的转化。结果表明，圣草酚是一种能抑制RSK2激酶活性的天然化合物，可能通过RSK2-ATF1信号通路发挥抗肿瘤的作用[10]。
黄芩素通过下调p38MAPK依赖性NF-kB通路信号抑制MMP-2的表达，降低肿瘤侵袭能力，还可通过下调caveolin-1/AKT/mTOR信号通路抑制雄激素非依赖性前列腺癌细胞转移。近来血小板活化和肿瘤转移的相关性得到普遍认识，黄芩素能够抑制激动剂和肿瘤细胞诱导的血小板聚集，并抑制肺肿瘤转移，其机制与黄芩素增强cAMP介导的血管扩张剂刺激磷蛋白磷酸化以及干扰MAPKs和PI3K-AKT信号活性相关[14]。
豆甾醇对于SMMC-7721的抑制作用呈现剂量、时间相关性，且可显著下调Fos、Myc、Ras等多种癌基因，上调NF-2为代表的抑癌基因及磷酸激酶Map2k6的表达；豆甾醇在体外、体内对肝癌细胞均具有一定抑制效果，通过增加G0/G1期细胞比例、降低G2/M期细胞比例、上调Map2k6的表达、下调肝癌细胞内的Bcl-2基因的表达，促进肝癌H22细胞凋亡[15]。
关键靶点PPI中筛选出核心蛋白成分为AR、CASP3、CASP9、ESR1、ESR2、KCNH2、PTGS2和SLC6A4，通过分子对接发现核心蛋白成分与“半枝莲–山慈菇”的活性成分有较好的对接活性，其中前列腺素G/H合酶2（PTGS2）与豆甾醇对接活性最好，PTGS2在乳腺癌及多种恶性肿瘤中呈现高表达，其可促进肿瘤细胞生长、诱发肿瘤耐药。PTGS2的表达与乳腺癌临床病理相关，如腋窝淋巴结转移、肿瘤病理级别高、激素受体状态、原癌基因人类表皮生长因子受体-2（HER-2）水平高表达等，且与增加致瘤性、血管生成等存在显著关系。研究发现，PGs的代谢产物对炎症和致癌因子有一定作用，通过PTGS2衍生PGs来调节芳香化酶表达和活性，减少PTGS2的表达与活性可抑制肿瘤的诱导和进展[16]。豆甾醇与PTGS2对接活性好，有效抑制了PTGS2的表达，可以预测为“半枝莲–山慈菇”治疗乳腺癌的可能作用靶点。多个活性成分与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（CASP9）都体现了良好的对接活性，研究表明该蛋白可通过凋亡体、细胞色素c蛋白复合物和凋亡肽酶激活因子1进行自蛋白分解和激活；在细胞凋亡中起核心作用，是肿瘤抑制因子[17-19]。“半枝莲–山慈菇”与该蛋白对接活性良好。综上所述，“半枝莲–山慈菇”可能通过影响肿瘤的血管生成、促进肿瘤细胞生长、抑制肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞黏附与迁移、影响机体免疫反应等过程抑制乳腺癌的表达。
通过网络药理学的GO富集分析和KEGG富集分析发现，“半枝莲–山慈菇”可能通过G蛋白偶联受体对免疫系统的调节，使多种趋化因子通过G蛋白偶联受体发挥作用，其它属于此类的G蛋白偶联受体包括白介素受体（interleukinreceptor）和参与炎症与过敏反应的组胺受体（histamine receptor）等[20]。Bcl-2家族蛋白复合物影响细胞凋亡，Bcl-2家族的2种促凋亡蛋白Bax和Bak使线粒体外膜通透化，线粒体膜间隙蛋白如细胞色素C、SMAC和Omi等释放到细胞质中，细胞色素C促进Apaf-1的寡聚化，并由Apaf-1寡聚体募集并活化Caspase-9、SMAC和Omi，导致下游的Caspase-3以及核酸酶等被活化，随之维持细胞生存的蛋白质和核酸被降解，细胞凋亡发生，通过细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物CDK控制细胞周期[21]。
本研究运用网络药理学的方法，对“半枝莲–山慈菇”对治疗乳腺癌的作用机制进行探究，同时采用分子对接方法对核心靶点与关键成分进行对接验证，间接证实了本研究的预测的准确性和可靠性。由此看出“半枝莲–山慈菇”治疗乳腺癌是多靶点、多途径的，为后续研究提供了理论基础。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：胡宴彬，魏瑞波，代甜甜，韦雅芝，王 欣．基于网络药理学和分子对接技术探讨“半枝莲–山慈菇”抗乳腺癌的作用机制 [J]. 现代药物与临床, 2021, 36(9): 1774-1781 .