实验室“迷你版”达尔文进化——定向进化
从恐龙时代到人类现代文明，自然界生命万物无时无刻不在进化发展、繁衍生息。生物进化的基本环节可概括为：突变、选择（海选/选拨）、隔离（优秀选手单独培养）、优良性状的脱颖而出或物种形成。在这个过程中，随机的基因突变一旦发生，就受到自然选择的作用，但是新性状特征的稳定或物种的形成则可能需要上万年时间的演化。
随着科学的进步和基因工程技术的不断发展，科学家们不禁设想：是不是可以在实验室创造出各种可能的基因突变组合，来模拟和加速自然进化和筛选的过程？按需设计，对症筛选，快速得到我们想要的功能为人类造福呢？
带着这种思考，美国加州理工大学的Frances H. Arnold教授率先将这种想法付诸于实施，用于生物酶的定向进化（Directed evolution），并在绿色化工、生物能源、医药等领域取得了一系列开创性成果。她本人也因此获得2018年诺贝尔化学奖。下面我们就来看看这项革新性技术是怎么运作，以及它对人类生产生活做出了哪些美好贡献吧！
图1 自然进化到实验室定向进化（图片来源：诺贝尔奖委员会（左）；FH Arnold, 2018 (右)）
如何实现生命载体——蛋白质的定向进化
蛋白质是生命活动的执行者。酶（enzyme）也是一种蛋白质，是生物体内的高效催化剂，生命体进化了形形色色、功能各异的酶和蛋白质催化细胞内各种化学反应和新陈代谢过程（如食物的消化，毒物的分解，养分的合成，植物的光合作用等）。这些反应和功能帮助细胞更好的适应其特定的生存环境，也可被聪明的人类利用来生产各类化学品、抗生素和药物等，减少化学合成法的环境污染问题。
然而生物体内天然酶的任务仅为满足自身生命活动所需，无需提优或额外作业，人类若要利用它们进行生产和工业制造，就要改造它们，把它们训练成各行各业的精英甚至身怀绝技的特种兵。定向进化则可以说是打造这种精英速成班或特种兵训练营的工具。
前面提到，自然进化的关键是突变和筛选。同样，实验室定向进化也是以这两项技术为基础来运作实现的。定向进化是一个迭代重复的过程，包括：初始目标蛋白的选定、基因的突变（多样化）、高效蛋白表达和筛选策略的制定和运行，然后对筛到的优良突变体基因进行再次的突变和筛选。多次循环，优中拔优，直到获得满意的性能，如：提高的酶活性，提高的抗体结合力，酶底物特异性的改变，甚至创造全新的反应类型等。
图2 酶定向进化技术流程图（图片来源：诺贝尔奖委员会，作者整理）
那么，如何对一个（目标蛋白或酶的）基因进行突变，构建一个包含它各种可能突变体的基因文库呢？这对科学家们来说已经是“小菜一碟”了，现代分子生物学和基因工程技术的发展已促生了许多成熟可靠的基因突变文库构建方法，基本1-3天就可以完成突变文库的构建。
图3是一些常见的突变体文库构建方法，1) 易错PCR：即故意在DNA扩增时随机引入错配，以获得该基因的各种突变形式，构建随机突变文库。2）DNA“洗牌”（DNA Shuffling）：将两个以上序列和功能相近但来自不同物种的同源基因（相似度至少>50%）随机切成小片段（如：25-100 bp），不同小片段之间互相交错叠搭，重新组装，形成全新的多种杂合形式的完整基因片段（Stemmer, 1994），这属于同源重组法，可快速将各个有益突变进行组合，就如同集父母优点于一身的孩子。3）对一些已知结构的蛋白来说，科学家们还可以有针对性的选择那些与功能发挥最相关的氨基酸，将它们突变为其他氨基酸，建立”小而精”的基因突变文库达到快速优化酶催化性能的目的（这也叫酶的半理性设计），德国马普煤炭研究所的Manfred T. Reetz教授是这方面的领军人物。4）随着对酶分子蛋白序列-结构-功能关系认识的深入，以及计算生物学的发展，科学家们也开始利用计算机来模拟突变，通过一系列生物信息学算法快速准确的预测各突变体的稳定性、活性和底物结合特性等，从而有选择性的去建库表达和筛选，将繁重的文库遴选工作交给计算机进行，缩小了人工筛选的范围。尽管这方面对计算的依赖性很大，目前成功率还不是很高，但相信计算机虚拟定向进化（in silico-directed evolution）将会是未来发展的一个重要方向。
图3 几种基因突变文库的构建方法
蛋白表达和筛选：数以万计甚至亿计容量的基因突变文库建立后，首先要进入细胞表达成为功能蛋白才能进行筛选和验证。常用的表达宿主有大肠杆菌，酵母和枯草芽孢杆菌等。进入宿主后，含每个突变体选手的细胞各自分离，八仙过海各显神通（功能）。这时，面对海量的突变体选手，简便快速高效的筛选方法就像是能够有效识别千里马的伯乐，是定向进化能否成功的关键。
高通量的筛选方法一般通过浊度、颜色、荧光或化学发光等光学特性达到快速评估的目的。比如：根据酪蛋白平板上形成透明水解圈的大小来判断蛋白水解酶活性的高低；利用酶底物或产物自身或与特定试剂反应后能呈显颜色或激发荧光的特性，根据颜色或荧光的强弱判断酶活性的高低；根据所携带荧光报告因子的发光强弱将含突变体的细胞进行分拣筛选；甚至还可将每个突变体的催化反应包裹在微小液滴中，当液体流过荧光分拣仪时将不同突变选手优胜劣汰。
这些方法的筛选量可达104-109（如微液滴法）个突变体，我们可以根据不同需要来量身定制。当然，也并不是所有的化学反应都能够找到快速高效的筛选方法，因此，针对不同蛋白、不同的功能和特性，科学家们还在努力不断开发出更多、更先进的筛选方法。这样，经过几轮的定向进化淘选，初试和复试，出类拔萃的选手就会脱颖而出。
图4 常用定向进化文库筛选方法（图片来源：Packer & Liu，2015。作者整理）
定向进化技术的应用——对人类生产生活的贡献
定向进化自发展以来广泛应用于基础科研、绿色化工和制药行业。不仅用于提升酶已知的催化特性，以更加绿色环保的方式来生产塑料、农药、燃料等；还赋予酶催化自然界从未有过的化学反应的能力，使其在工业上具有更广泛的应用潜力。如：
提高酶在特殊环境下的稳定性和活性：1993年，定向进化技术开创者Arnold教授，对枯草杆菌蛋白酶E进行多轮易错PCR随机突变，使其在有机溶剂DMF中稳定性增强，活性提高了256倍。就如同给该酶披了件铁布衫使其在恶劣的有机工业环境中仍能孜孜不倦的工作，大大提高了其合成药用高分子化合物多聚-L-甲硫氨酸的能力。
改变酶的底物或产物范围：类胡萝卜素具有抗氧化活性，在抗肿瘤或慢性疾病治疗方面具有潜在的应用价值。Arnold团队对类胡萝卜素合成途径进行定向进化，利用DNA洗牌术改造八氢番茄红素去饱和酶，首次在大肠杆菌中合成新型非天然类胡萝卜素化合物。2018年Pawlowski等改造大环内酯激酶的底物特异性，成功合成新型抗生素前体。2011年Bastian等改造异丁醇生物合成途径中的酶，使异丁醇以100%的理论产率合成，用于工业大规模生产异丁醇生物燃料。
改变酶的对映体选择性：Arnold团队通过反转海因酶的对映体选择性来合成L-甲硫氨酸，Pavlidis等通过改造转氨酶的活性和立体选择性合成手性胺等，均对工业生产和制药行业具有重要意义。
抗体的定向进化：定向进化在抗体亲和力改造和抗体药物筛选方面也取得了很大成功。如2002年FDA批准上市用于治疗类风湿性关节炎的阿达木抗体即是利用进化筛选来的人源化抗体，彻底解决了异源抗体的免疫排斥问题。
催化新的化学反应：2016年Ellefson等曾通过定向进化赋予了逆转录酶几十亿年来所没有校对纠错功能。Arnold等对P450酶的改造赋予了该类酶一系列催化全新反应的能力，如：杂环烯烃的卡宾反应，反马氏烯烃氧化反应和不对称合成烯丙胺的反应等，在生物燃料、化工合成和医药领域具有广阔的应用前景。
最引人注目的是“女神”Arnold团队2016年改造细胞色素C氧化酶，使其具备了前所未有的“碳-硅”键形成能力，将硅元素引入生命有机体。该重大发现除了可以更经济环保的方式生产有机硅化合物，应用于制药、半导体等行业，还一度引起不少人惊呼构建“硅基生命”的可能性。
图5 细胞色素c突变体的血红素蛋白在大肠杆菌细胞内催化碳-硅 (C-Si) 键形成，室温高效合成有机硅化合物（图片来源：Kan et al, Science，作者整理）
目前地球上发现的生命有机体皆是以碳元素为基础的碳基生命，那些出现在科幻小说和电影中的地外生命形式有朝一日会出现在我们的生活中吗？硅基生命真的可能存在吗？或许我们对地外生命形式的认识正在拉近，这些问题将会由未来的科学家们去探索、发现和创造。
酶和蛋白质的定向进化现已成为生物工程领域的“硬核”技术手段，不仅加深了我们对蛋白质结构-功能关系的认识，也为人类生活带来了福祉。它不仅可以针对某一蛋白进行改造，还可以改善细胞代谢途径、优化代谢网络、获得期望表型的细胞，是将来合成生物学开发更多、更精确的功能元件，设计组装新生物系统强有力的工具。正如Arnold所说“我们在教酶如何进化的同时，自身也在不断学习进步”。
参考文献:
1. FH Arnold. Directed Evolution: Bringing New Chemistry to Life. Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 4143 – 4148
2. 曲戈，张锟，蒋迎迎，孙周通，2018诺贝尔化学奖：酶定向进化与噬菌体展示技术，生物学杂志，2019，36（1）：1-6
3. RE Cobb, R Chao, H Zhao. Directed evolution: Past, present, and future. Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 59, 1432–1440.
4. MS Packer, DR Liu. Methods for the directed evolution of proteins. Nature Reviews Genetics. 2015, 16, 379–394.
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7. F Ma, MT Chung, Y Yao, R Nidetz, LM Lee, AP Liu, YF, K Kurabayashi & GY Yang. Efficient molecular evolution to generate enantioselective enzymes using a dual-channel microfluidic droplet screening platform. Nature Communications. 2018, 9: 1030
8. JW Ellefson, J Gollihar, R Shroff, H Shivram, VR Iyer, AD Ellington. Synthetic evolutionary origin of a proofreading reverse transcriptase. Science, 2016; 352 (6293): 1590-1593
来源：中国科学院青岛生物能源与过程研究所