流式细胞术操作重点
流式细胞术（Flow Cytometry ，FCM）实验操作中存在各种可变因素，包括仪器设备、样本处理、试剂、操作过程、数据分析等。
前期针对流式细胞仪进行了原理的详细介绍“涨姿势啦！流式细胞仪的原理简介”。
今天我们针对在操作过程中遇到重点可变因素进行介绍，看如下：
有严重溶血、凝聚或坏死的样本应弃用。
外周血和骨髓穿刺液为天然单细胞悬液;活检组织常用机械分离和酶消化两种方法。不同的实验要求适用不同的方法。
对于需要进行膜抗原标记的，不仅是要获得足够的单细胞悬液，还要尽量保证细胞结构的完整性和抗原性，机械法较适用。
只需进行细胞周期或DNA倍体分析的，在机械法的基础上加酶消化(如胰蛋白酶、胃蛋白酶等)较适用。
外周血标本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。
如果用同一份血标本做白细胞计数和流式分析，则应用EDTA抗凝;对于血小板分析的实验，一般不用肝素抗凝。骨髓穿刺液常用肝素或EDTA抗凝。
由于相对大量的ACD会通过改变pH而影响骨髓细胞活性问题，通常不推荐用ACD作骨髓穿刺液的抗凝剂。
理想状态下，样本应在采集后立刻进行处理和染色。
肝素抗凝的血和骨髓通常可保存至48-72小时/室温(16-25);EDTA抗凝的外周血和骨髓可保存12-24小时/室温(16-25); ACD抗凝的外周血可保存至72小时/室温(16-25);对于只作胞内染色的样本，可固定细胞以长期保存。
但此“固定-染色”的方法取决于要分析的抗原特性和染色方式。
去除红细胞的方法：细胞裂解法，操作简单、快、并最可能保持原始标本的白细胞分布。最好在染色后溶血。
若在染色前溶血，需确认:
1)抗原性不被溶血过程改变
2)溶血剂被彻底洗去，细胞和抗体结合的动力反应未受影响
3)所用溶血剂不含固定剂，否则会影响细胞活性及表面标记结果。密度梯度离心法，靶细胞回收较好并可能得到富集，同时去除红细胞、碎片等，但费时，某些重要细胞群体可能被选择性丢失。
厂家推荐的抗体用量通常是假定靶细胞数量在5X10~1x10范围内。
有些标本没有足够的细胞，有些则由于细胞量大，正常浓度下的抗体相对过量或不足，导致假阳性或假阴性结果。
因此，每个实验室应根据不同于厂家推荐的方法，调整细胞与抗体用量，得到最适的细胞/抗体比例。
死细胞对许多抗体均有很强的非特异性染色，这就使样本细胞活性检测变得非常重要。
尤其是经过了长时间运输和储存的样本。检测的方法通常有两种:
1)实时的流式检测:利用荧光染料碘化吡啶(PI)、 7氨基放线菌素D (7-AAD)或EMA (ethidium monoacide) 进行死细胞染色，而活细胞拒染这些染料。
此方法的优势是细胞表面标志和活性分析可同时进行。尤其适用于高度坏死的样本。
7-AAD最常用，因为在488nm激发下，其最大发射光在670nm左右，适合与FITC或PE进行多色标记。
但随着时间延长，7Aad会在固定的细胞群体重新分配，死活细胞的区分变得困难。
因此，对于染色并在固定后12小时以上分析的标本，最好用EMA。
EMA与死细胞DNA稳定的共价结合保证了长时间固定后仍能很好地区分固定前的死活状态。
2)手工检测:使用Trypan blue或其他细胞活性染料。
操作时必须严格按照孵育时间，如果抗体孵育时间过长，荧光是会逐渐淬灭的。
那如果不得不推迟实验怎么办？可以把试管放在冰里面，这样会稍稍延长淬灭的时间。
在进行多荧光染色的时候，相同的细胞会因为染色顺序不同而导致荧光强度的差异。解决办法为：预实验。
做一系列的不同染色顺序的样本，通过对染色前和染色后的各种样本进行比较分析，判断染色顺序对细胞造成的影响。
染色方案不合理也可能会导致荧光染色信号太弱。解决的方案：预实验。
在正式开始实验之前，通过预实验，设计出一个完美的染色方案。
（考虑试剂种类，试剂质量，试剂用量，孵育时间，洗涤次数，染料浓度，染色时间及染色温度等其他因素。）
细胞阴性对照可以显示细胞基准的荧光水平。
同型对照则是为了查看抗体非特异性结合的水平。
选择同型对照需要注意采用相同物种、相同亚类、相同染料、相同浓度，否则，检测的时候会出现乱七八糟的同型对照结果。
通用原则是：为表达最弱的抗原选择染色指数最高的荧光素。
根据使用的流式细胞仪性能、激光器、滤光片种类来选择。
对于多色实验，需选择发射光谱重叠小的染料。（详细内容就不详述，可以查看往期内容：“如何选择合适的流式抗体”）
数据的获取必须是在仪器性能的校准均合格的基础上进行。
仪器散射光和荧光信号的光电倍增管电压、增益、颜色补偿等参数的设定会直接影响结果。
电压的调节需根据阴性对照管来调节。
可以以任意参数及多个参数的组合作为阈值；大多数样本都可以设定FSC/SSC；阈值以下的信号不存储；可以根据阴性对照管来调节。
目的是将不需要的杂质信号，噪音信号，无用的细胞信号等扣除，使收集到的都是有用信号。
流式细胞分析中经常要用到2种以上的荧光标记抗体进行染色，而目前所使用的多种荧光染料发射谱间有一定重叠。
荧光补偿则可以从探测器种除去匹配荧光以外的任何荧光信号。
补偿方式：任意两个通道之间都可以调节。
补偿的调节：根据单染对照管来调节。