基因敲除细胞系介绍及应用案例

通过病毒法，化学转染法或电转法将gRNA和Cas9转入细胞中，根据转染方法不同进行不同时长的药筛，药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序验证，筛选出移码基因敲除的阳性克隆。

基因敲除细胞系应用案例：

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞被用作生物工厂，用于生产一系列重组治疗蛋白，包括单克隆抗体和Fc融合蛋白。宿主细胞蛋白（HCP）是必须从治疗制剂中去除的杂质，因为它们具有潜在的免疫原性风险。虽然在典型的下游净化过程中，大多数HCP杂质被有效去除，但清除少量存在的HCP仍然是一个挑战。利用CRISPR/Cas9系统建立Anxa2和Ctsd基因敲除CHO细胞系，并证实了细胞裂解液中HCP完全消除。在培养过程中，所有的基因敲除细胞系都显示出与野生型对照相似的生长和活力。因此，敲除非必需基因可以减少重组治疗蛋白生产中HCP的污染。

（a）sgRNA打靶Anxa2基因的4号外显子。对序列进行双向分析。

（b） sgRNA打靶Ctsd基因2号外显子。对序列进行双向分析。

用SDS-PAGE和WB分析鉴定CHO基因敲除细胞株的蛋白表达。
（a） Anxa2基因敲除细胞系。
（b） Ctsd基因敲除细胞系。细胞培养上清液（47μg蛋白）和细胞裂解液（20μg蛋白）经4-20%SDS-PAGE分析。
CBB染色检测总蛋白。利用各自的捕获和检测抗体对每个蛋白质进行WB分析。星号表示非特定波段。双星号表示组织蛋白酶D的片段

在蛋白质表达分析中，没有观察到CHO-K1（WT）细胞系中的细胞培养上清液中的膜联蛋白A2和组织蛋白酶D。对贴壁的CHO-K1细胞进行静态培养，在培养过程中没有物理应力诱导细胞裂解，这表明CHO细胞分泌的这些蛋白质数量相当少。此外，在对Anxa2和Ctsd基因敲除细胞系的蛋白质表达分析中，没有观察到任何截短的HCP。