液体活检：ctDNA检测独占鳌头
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年度关键词
6月底在“Top 10 Emerging Technologies 2017”上公布的全球十大新兴技术中最直接与医疗相关的就是——液体活检（liquid biopsies），尽管2017年才过去一半，资本市场在肿瘤液体活检市场的投入已超过13亿美元，十足“火热”。
常规检测：组织
有创、获取困难异质性
液体活检：外周血
无创、易于获取综合评估
*来源 My Cancer Genome
如上图所示，与传统的组织活检相比，穿刺针取组织与采血管采血，不管是从耗时耗材、人员要求、患者身体状态以及感染扩散等因素，更进一步涉及到肿瘤异质性，液体活检的先天优势显著。
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血液的秘密
*全血和血浆内各组分的组成
虽然唾液、尿液等体液中也存在游离DNA，可作为检测来源，但目前最适用于临床的还是血液。1mL血约能提取出15ng游离DNA，相当于来自约2000个细胞的DNA量，所以，血液中ctDNA的量是极少的。上图显示了血液的不同组成成分，并大致地对其做了定量，液体活检专注的是血液中来自肿瘤的细胞、DNA以及其他肿瘤标志物，主要集中于血浆，但因为含量极少，而且容易和血浆蛋白相结合，因而常规的提取效率都不高，目前商品化的试剂盒绝大多数都是基于微柱吸附法和磁珠吸附法，如MagNA Pure isolation system（Roche Diagnostics）和QIAamp DNA Blood Midi Kit（QIAgen），富集技术的逐步发展正推进着检测的精准性
肿瘤相关的标志物，特别是释放到血液里的标志物，在肿瘤不同的阶段有不同的特征，代表肿瘤发展的状况。所以在肿瘤的不同阶段，液体活检会有不同的意义和它存在的价值。
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液体活检“三足鼎立”
液体活检是个大而化之的名词，其内在包含着多个研究方向，若论现在讨论得比较多的标志物就是循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）以及外泌体（Exosome），当然，随着研究的深入，这“三个大鼎”后继还是有料的。
在这之中的循环肿DNA（ctDNA）是由肿瘤细胞释放到血液循环系统里面的DNA，它主要是来源于坏死、凋亡的肿瘤细胞以及外泌体破裂之后释放的DNA。ctDNA和另外两者比，是直接在分子层面的，最直观也最易分析，高通量测序的发展，使全基因组关联分析（GWAS）得到数据支持，进而提供基因检测指导靶向药物的临床意义，因此给了比CTC晚发现的ctDNA“弯道超车”的机会。
*ctDNA的来源
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CtDNA的黄金时代
基于ctDNA检测的液体活检在2015年就拿到突破性技术大奖，势头猛烈。PET/CT技术能发现直径大于5mm的肿瘤组织，但2mm是肿瘤生长的关键时期，因此基于分子层面的基因检测是未来肿瘤早筛的必然趋势。关于ctDNA检测，可以深入浅出地逐步探讨一下。
*来源网络
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研发历程
早在1948年，研究发现细胞核内的DNA并非一直躲在核内，也有游离在外的，所有游离在血液中的DNA统称为cfDNA(cell-free DNA)，而来自肿瘤细胞的cfDNA就是ctDNA。1977年，有研究证明，肿瘤患者血浆游离DNA含量高于健康人群。到了1994年，科学家通过识别ctDNA身上携带的肿瘤特异性的基因突变（KRAS突变），首次区分出来源于肿瘤的游离DNA。
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基本特征
■ 含量低、浓度低
根据已有研究，ctDNA 在 cfDNA 中的占比在0.01%～1%，受到癌种、时期等因素的影响。晚期癌症患者的血浆中 ctDNA 的含量较高，研究也相对较多，而 ctDNA 在早期癌症中的研究则受限于 ctDNA 的含量。实际上，ctNDA研究是在近十年才有了突破性的发展，但随着多种测序技术的升级，ctDNA检测的灵敏度和特异性都得到了大幅度提高。
■ 突变频率低
液体活检大咖企业Guradant health做过一个大样本研究，发现游离DNA里面肿瘤相关突变的等位基因频率（variant allele frequency，VAF），也就是突变频率是非常低的，证明ctDNA大部分的突变都是低频率的。
*1000例癌症患者cfDNA中的单核苷酸突变
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检测方法
*ctDNA的检测方法对比
对于已知突变，一般有基于PCR的方法，如ARMS-PCR，基于数字PCR，如BEAMing和ddPCR。而对于高通量平台，如TAM-seq和CAPP-Seq是检测已知突变的，但全外子组甚至全基因组测序等则可以检测未知突变，加入单分子标记后，大大提高了有效测序深度，检测下限能达到十万分之四，对于“三低”的ctDNA来说，高通量测序平台犹如打开它黄金时代之门的钥匙。
去年国家卫生计生委临床检验中心对全国肿瘤游离DNA（ctDNA）基因突变检测室间质量进行了评价，目前应用最广泛的技术是ARMS-PCR、数字PCR与NGS平台。其中ARMS方法具有操作简单、成本低廉的优势，但假阳性假阴性都不可避免，稳定性较差，数字PCR检测游离DNA相对最稳定，而且易于掌握、准确度高，特别适合ctDNA检测及临床推广。NGS平台则可同时检测多个基因的多种不同变异形式，对于ctDNA的科研有极其重要的作用，并且也适用于目前临床的诉求，但也从质检结果体现出NGS实验室是目前管理最为良莠不齐的，因此要普及NGS检测ctDNA技术需要对实验操作流程与数据处理以及标准化提出更高的要求，今年下半年我们也可以期待一下新的质检报告。
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应用方向
*ctDNA的潜在应用
CtDNA的应用已经覆盖人体绝大多数的实体瘤，在此总结一下目前热门的两个应用。
■ 肿瘤早期诊断
在含量上，肿瘤患者与健康人群有明显差异，一般来说肿瘤患者要高很多，但是也不可避免有个体差异，但个体差异的造成也可能是提取技术的不成熟。而且转移后的肿瘤，肿瘤突变负荷高，分期越晚，肿瘤突变率也越高，这对于ctDNA检测都是有益的。加之TP53作为人体内重要的抑癌基因，许多团队希望通过它的检测来预测肿瘤发病风险，现在也有通过ctDNA来筛查TP53突变的，相互辅助或许可以使TP53更有力地成为风险预测的靶标。
■ 耐药评估
这一应用可以说是目前ctDNA最热门的研究方向，可跟踪获得性耐药突变，来进行个体化用药指导。因为耐药追踪需要多次取样，对于无创的液体活检技术而言优势比较大，不管是术前术后，不管取样频率多高，患者都是可以耐受的，特别针对一些晚期癌症患者，能及时反映出耐药突变的发生，替换靶向药物的使用，使得治疗方案优化。
*通过ctDNA监测患者体内肿瘤驱动突变
*通过ctDNA监测NSCLC患者对奥西替尼的药物反应，组织和血检具有一致性
当然除此之外，在肿瘤发展监控、术后疾病残留等方面，ctDNA检测也在大展拳脚。但也不可避免遇到瓶颈，比如无法准确预知肿瘤纯度，ctDNA中的低频突变极易被漏检，这和组织检测相比就显现了劣势，基础科学对于肿瘤发展机制的深入追究才可解决ctDNA应用的局限性，才能完善上述两个应用方向，毕竟早筛早诊目前来讲还处于科研阶段。
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液体活检在衡道
上海衡道医学病理诊断中心 提供多种个体化用药套餐，以基于ctDNA检测的液体活检技术，推出包括非小细胞肺癌8基因/76基因、胃肠癌60基因及多癌种133基因的检测套餐，满足临床多种需求，且具有针对性，协助医生制定最优治疗方案。
● 安全无创
对于无法手术或不耐受穿刺的患者及需要持续监控疾病的患者，仅需15mL外周血，提取循环肿瘤DNA，1毫升血约能提取15ng游离DNA，相当于来自2000个细胞的DNA量。
● 精准专业
拥有基因组污染识别专利及自主研发的单分子标记技术，检测灵敏度高、特异性强，对目标区域的覆盖率超过99%，液态活检技术同时可以避免肿瘤组织的异质性等问题。且具备完善的数据库资源与优秀的临床专家团队，可出具科学严谨的报告，并持续跟进用药和转归。
参考资料
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