单细胞测序揭示PD-L1免疫治疗联合紫杉醇化疗在三阴性乳腺癌中的作用机制
文章信息
题目：Single-cell analyses reveal key immune cell subsets associated with response to PD-L1 blockade in triple-negative breast cancerr
时间：2021年10月
期刊：Cancer Cell (IF: 31.7)
DOI: https://doi.org/10.1016/j.ccell.2021.09.010
总览
在三阴性乳腺癌（TNBC）中，将化疗与检查点抑制剂相结合的好处仍然不是很清楚。作者利用单细胞RNA和ATAC测序来检查22名患有晚期TNBC的患者的免疫细胞动力学，这些患者的治疗方法是紫杉醇或与阿特珠单抗 (Atezolizumab)的结合。我们证明，高水平的基底CXCL13+ T细胞与巨噬细胞的炎性特征有关，可以预测对组合疗法的有效反应。在反应灵敏的患者中，淋巴组织诱导（LTi）细胞、滤泡B（Bfoc）细胞、CXCL13 +T细胞和常规1型树突状细胞（cDC1）在联合治疗后协同增加，但在紫杉醇单一疗法后则减少。我们的数据突出了CXCL13 +T细胞在有效应对抗PD-L1疗法方面的重要性，并表明通过紫杉醇疗法减少这些细胞可能会损害伴随阿特珠单抗 (Atezolizumab)进行TNBC治疗的临床结果。
样本信息和实验设计
研究人员收集了来自22例TNBC患者（11例接受阿替利珠单抗联合紫杉醇化疗，11例接受紫杉醇单药化疗）治疗前和治疗后的78例配对样本，通过整合单细胞转录组测序、T细胞受体序列测序和染色质可及性测序，构建了TNBC患者肿瘤微环境和外周血来源免疫细胞的高分辨率转录组和表观组动态图谱。该研究在单细胞水平上对来自接受两种治疗方案的TNBC病人的肿瘤组织和外周血的免疫细胞进行刻画，系统比较了响应患者和非响应患者的肿瘤微环境及外周血免疫特征，阐明了免疫细胞在不同治疗方案下的动态变化，揭示了anti-PD-L1免疫治疗联合紫杉醇化疗在TNBC中的作用机制。
单细胞测序技术
scRNA-seq(10x Genomics) , scTCR-seq和scATAC-seq
部分分析结果
使用不同疗制治疗的晚期TNBC患者的免疫细胞动力学
经过质量过滤，获得了489，490个高质量免疫细胞的单细胞转录组数据，其中包括骨髓细胞、先天淋巴细胞（ILCs）、T细胞和B细胞（图1B）。根据Pi分析，发现B细胞是最突出的免疫细胞类型，可以预测对两种治疗方案（图1C）的有利反应。为了在人类TNBC中生成一个全面的免疫细胞图集，进一步将来自血液或肿瘤的每一个主要免疫室单独隔离（STAR方法）。揭示了具有不同分子特征的异质免疫细胞亚型，表明它们具有独特的细胞特征（图1B、1D）。
肿瘤渗透T细胞子集的时空动力学
CD8-CXCL13 和 CD4-CXCL13 在 TNBC 肿瘤中扩展，对组合疗法有反应。为了破译治疗后的免疫细胞动力学，我们首先研究了不同T细胞子集上紫杉醇的调节。与非响应者相比，响应者显示CD8-CXCL13、CD4-CXCL13和Tregs水平下降，同时在紫杉醇治疗后CD8 Tem、Teff和CD4细胞水平升高（图2B、2C和S2D）。有趣的是，CD8-CXCL13 和 CD4-CXCL13 在紫杉醇加阿特珠单抗治疗后，在反应灵敏的患者中都有所扩大，导致他们在联合治疗组中所占的分数高于治疗后单独的 paclitaxel治疗（图 2B、2C 和S2E）。同样，我们的 Ti 分析也显示了组合治疗后 CD8-CXCL13 和 CD4-CXCL13 的扩展，相比之下，在反应灵敏的患者中，在 paclitaxel 治疗后，它们的减少（图 2D 和S2F）。这种观察暗示了CXCL13 T细胞与PD-L1封锁的相关性。我们进一步利用TCR序列来追踪对联合疗法有反应的肿瘤中CXCL13 T细胞的血统起源，并发现其扩张既包含预先存在的克隆，也包含新渗透的克隆（图2E和2F）
TNBC肿瘤中B细胞子集的特点和动态
我们观察到CD19 B细胞与CD8-CXCL13和CD4-CXCL13 T细胞在TNBC肿瘤中与紫杉醇加阿特朱单抗（图3A）的共定位。通过比较反应性肿瘤和非反应性肿瘤之间B细胞的转录差异，我们发现，在反应性肿瘤中富含的B细胞，在抗原处理和表达途径、干扰素（IFN）-γ反应和T细胞活化等途径中具有高度表达的基因。相比之下，富含非反应性肿瘤的B细胞在B细胞活化、免疫球蛋白生成和幽默免疫反应的通路中表现出高度表达的基因（图3B和S3D）。
Bfoc 和 Lti 细胞在 TNBC 肿瘤中协同扩张， 对组合疗法有反应。值得注意的是，Bn、Bmem 和 Bfoc 细胞主要富集于对紫杉醇和阿特朱单抗有反应的肿瘤，而不是对紫杉醇有反应的肿瘤（图 3C 和S3G）。反应者比两个治疗组的非反应者（图3C和S3G）的基线Bfoc水平要高得多，我们的Pi分析也显示了Bfoc与有利的临床反应（图3D）的关联性。重要的是，我们描述了不同的B细胞子集的预后意义，并揭示Bfoc是最重要的B细胞亚型，与BRCA患者的有利临床结果相关（图3E：star方法） 。因此，Bfoc似乎是患者生存和ICB免疫治疗中最重要的B细胞子集。
接下来，我们检查了Bfoc与其他免疫细胞的连接。通过描述相关免疫细胞亚型，我们发现CD4-CXCL13和CD8-CXCL13在细胞比例上与Bfoc呈高相关性，特别是在治疗后组（图3F和S3J）。值得注意的是，ILC3-IL7R可以预测对这两种治疗方案（图3J）的有利反应，表明其在有效抗肿瘤免疫方面的潜在作用。
cDC1 在 TNBC 肿瘤中扩展，对组合疗法有反应
mDC与TNBC肿瘤中的cDC1紧密相连，由于其转录相似性和细胞比例的相关动态变化（图4C和4D）。对于使用紫杉醇加阿特珠单抗治疗的患者，我们还观察到，与 cDC1 和 pDC 的增加相比，治疗后响应者中的 mDC 减少，这可能是由于 paclitaxel 方案选择性地减少了 mDC（图 4B）。值得注意的是，mDC 和 cDC1 都展示了与 CD4-CXCL13（图 4D 和S4H）协调的时间动力学，我们通过 TCGA BRCA 的批量 RNA-seq 数据（图 4F）证实了它们的相关性。此外，我们还发现了多个配体受体对，包括 CD40LG-CD40，这些配体受体对可能会在 mDC、cDC1 和 CD4-CXCL13（图 4G）之间进行调停。有趣的是，CD8-CXCL13还表现出与mDC、cDC1和CD4-CXCL13的高度相关性，基于它们在细胞比例上的时间动态（图4D和S4H）。这些观察暗示CD4-CXCL13和CD8-CXCL13可能都由cDC1或mDC激活。
巨噬细胞子集与TNBC肿瘤中CXCL13 +T细胞的连接
以单细胞/巨噬细胞隔间为重点，我们发现，与组合治疗组的响应者相比，无反应器表现出较高的巨噬细胞基线水平，在非响应器中富含的巨噬细胞高度表达SPP1、TREM2、FN1和C3，而在响应者中富含的巨噬细胞则高度表达CXCL9、MMP9和PLA2G2D （5A）。
我们还检查了免疫细胞比例，发现M+-CCL2和M+-MMP9也与CXCL13 T细胞（图5E）高度相关。值得注意的是，这两个宏噬菌体子集的基线水平较高，表明对组合疗法（图 5F）有良好的反应。
组合治疗后反应性肿瘤中T细胞子集的转录和表观遗传动力学
转录本分析表明，IFNG、GZMK、GZMA和CD44的效应基因和记忆相关基因：TBX21、BHLHE40和 BCL6 的转录因子（TFs）：CD28和ICAS的共刺激分子，以及HLA基因和集成物被调高，而疲惫相关的基因，包括HAVCR2，LAYN，TIGIT和LAG3，在治疗后在CD8-CXCL13中被降低（图6A).CD8-CXCL13的表型变化也反映在其疲惫分数的减少和效应者记忆分数的增加（图6B）。CD8-CXCL13细胞的表观遗传特征，显示T细胞衰竭标记物（包括PDCD1、LAG3和CTLA4）的峰值特异性丰富，与CD8 Tex细胞的表观遗传特征一致（图6c）。
我们通过比较组合治疗前后的配对 scATAC-seq 数据，检查了 CD8 Tem、CD8-CXCL13 和 CD4-CXCL13 的色度素可及性的全局动态。每个T细胞子集中微分OCR和相关基因的特征通报了CD8-CXCL13细胞的增强效应和记忆特性，表明CD44、CXCR4、KLRG1、XCL2、CST7、ICOS和CD28的可及性增强，而治疗后与衰竭相关的基因（如CREM和 MYO7A）的可及性降低（图6D）。
TNBC肿瘤免疫细胞特征和动态摘要
我们调查了晚期TNBC患者免疫细胞的时间动态，或与阿特朱单抗的结合，并发现了与患者反应相关的免疫特征（图7A-7C）。
(A） 经过不同治疗的关键免疫细胞子集的特征和动态。红色（或绿色）箭头表示较高的基线水平，预测有利（或不利）反应，或治疗后反应灵敏的患者免疫细胞子集的增加（或减少）。
（B） 反应迅速和无反应的肿瘤的免疫特征及其在不同治疗方案下的动态。具有实质性基线CXCL13+ T细胞、B细胞和促炎巨噬细胞的TNBC肿瘤，与具有大量免疫抑制巨噬细胞的TNBC肿瘤的耐药性相比，对组合疗法具有敏感性。紫杉醇疗法减少，而阿特珠单抗增加反应性肿瘤的关键抗肿瘤免疫细胞。
（C） CXCL13 +T细胞与其相关免疫细胞之间的潜在联系，根据治疗引起的时间动力学推断。
总结
综上，该研究揭示了TNBC患者对于anti-PD-L1免疫治疗敏感和耐药的分子机制，鉴定了关键免疫组分及其在免疫检查点抑制剂和紫杉醇化疗方案下的动态变化，阐明了紫杉醇化疗与阿替利珠单抗联合应用不能有效增加TNBC患者治疗效果的原因。该课题的研究结果对于当前免疫治疗联合化疗方案有重要指导意义，提示需要进一步系统评估不同化疗药与免疫治疗药联合使用的分子机制，才能有效提高联合用药方案对TNBC患者的治疗效果。