深度解析狼疮抗凝物实验室检测16问（上）-实验篇|C·驿站第6期
狼疮抗凝物是延长人体凝血时间的一种抗体，其实也是抗磷脂成分中的一种抗体。使体外测定PT、APTT延长，但临床不见出血现象，而易出现高凝状态/血栓并发症。针对检验结果、临床病症、干扰因素、报告形式、检测方法等老师们遇到的各种疑问，C驿站将分实验篇和临床篇一一解答，如有未涉及内容，也欢迎老师们提问补充。
问题1：狼疮抗凝物（lupus anticoagulant, LA）是什么？
狼疮抗凝物（lupus anticoagulant, LA）是一组能与负电荷磷脂-蛋白复合物或负电荷磷脂结合的免疫球蛋白，多数为IgG，少数为IgM或二者混合存在。因首先在系统性红斑狼疮（SLE）患者血浆中发现而得名。LA可以干扰依赖磷脂的凝血或抗凝血反应，如干扰FⅫ、FⅨ、FX、FⅡ的活化，使体外测定PT、APTT延长。但是，LAC与磷脂蛋白的复合物可干扰血栓调节蛋白（TM）与凝血酶结合对PC的活化，并与APC/PS复合物竞争磷脂表面，使APC灭活FVa和FⅧa发生障碍而导致血液高凝状态。
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问题2：目前狼疮抗凝实验室诊断指南？
（1）国际血栓与止血协会（ISTH）-2009年
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（2）英国血液学标准化委员会（BCSH）-2012年
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（3）美国临床实验室标准化协会（CLSI）H60-2014年
问题3：LA实验室检测的原理及诊断标准？
目前对于LA的检测均为功能性试验，其检测原理均基于LA在体外能作用凝血酶原复合物（FⅩa、FⅤa、Ca2+及磷脂）以及Tenase复合物（因子FⅨa、FⅧa、Ca2+及磷脂），延长磷脂依赖的凝血试验时间。
LA实验室诊断标准包括
（1）筛选试验（Screen test）：磷脂依赖的凝血试验时间延长；
√目前没有一种试验对LA具有100%敏感性，三种指南均推荐对LA进行两种不同途径的检测，以增加敏感性和准确性。澳大利亚皇家病理学院（RCPA）和CAP室间质评统计结果显示APTT和dRVVT是最常见的两种检测方法。
√ISTH 2009明确说明应使用硅为激活剂的APTT试剂。BCSH 2012和CLSI 2014未对激活剂种类进行限定，但仍要求选择对LA敏感度的试剂。同时CLSI 2014不排除其他筛选试验的使用
（2）纠正试验（Mixing test）：等体积患者血浆与正常血浆（normal plasma pool, NPP）混合均匀，未经孵育前进行相应筛选项目检测，以证实凝血时间延长不是由一种或多种凝血因子缺乏导致。
（3）确证试验（Confirm test）：确证试剂中含有高浓度磷脂，可中和样本中LA，使相关凝血检测时间缩短，以确认循环抗凝物是否具有磷脂依赖性。
问题4：LA结果报告表示方式？
混合试验结果可以循环抗凝指数（index of circulating anticoagulant, ICA）表示，即Ronser指数。ICA=[(1:1混合试验凝固时间-NPP凝固时间)/筛选试验凝固时间]×100%。
确证试验可以以下方式表示：
LA比值（筛选试验凝固时间/确证试验凝固时间）
标准化LA比值（筛选试验比值/确证试验比值，筛选试验比值=筛选试验凝固时间/筛选试验正常均值，确证试验比值=确证试验凝固时间/确证试验正常均值）
纠正百分比（%C =[(筛选试验比值-确证试验比值)/筛选试验比值]×100%问题
问题5：dRVVT是什么？
Thiagarajan P和Pengo V等于1986年首次报道dRVVT（dilute Russell's viper venom time ）检测方法的应用，蝰蛇毒能直接激活凝血因子FⅩ，在钙离子、凝血因子FⅤ和磷脂存在下，激活凝血酶原导致纤维蛋白凝块形成；而样本中LA会抑制具有凝血活性的磷脂，从而延长的dRVVT筛选试验凝固时间。
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问题6：实验检测流程的选择？
目前，ISTH、BCSH和CLSI发布的相关指南关于1:1混合试验的检测给出了不同意见。ISTH 2009指出在筛选试验检测结果延长时即需要进行1:1混合试验，混合试验结果提示阳性时再进行确证试验。
BCSH 2012指出了稀释效应可导致弱阳性LA检测结果出现假阴性，因此即使1:1混合试验结果阴性，但筛选试验和确证试验检测结果提示阳性时仍然判断检测结果为阳性。
CLSI 2014重新定义LA检测流程为筛选-确证-1:1混合试验，只有在筛选试验和确证试验结果难以解释时再进行1:1混合试验。
本室采用CLSI 2014指南流程。
问题7：用于LA检测的样本要求？
CLSI H21-A5对出凝血项目的标本采集、运输、离心条件和保存要求进行了明确规定，LA检测遵循上述规定。
需要强调的是，血浆中残存血小板表面磷脂可与LA相结合，使凝血时间缩短，从而导致检测结果假性降低。尤其是冻存标本冷冻及融化的过程将导致血小板激活，释放更多磷脂。因此，要求乏血小板血浆（PPP）中血小板计数需小于10×109/L，以减少血浆中残存血小板对LA检测的影响。
ISTH 2009和BCSH 2012要求对标本进行二次离心，见下图。CLSI 2014推荐实验室在室温下对样本以1 500 g，不少于15分钟条件下，单次离心以获得乏血小板血浆，若单次离心不能满足要求，则需二次离心。三个指南均不不推荐使用滤网进行过滤处理。0.22 μm乙酸纤维素滤网过滤会导致高分子量凝血因子和血管性血友病因子（VWF）等丢失，使凝血时间假性延长。因超速离心可能会产生影响检测结果的微粒，BCSH 2012和CLSI 2014也不推荐在第二次离心时选用超速离心。
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我室目前流程：
若按照上图要求进行二次离心，无法满足常规大批量样本检测。本室经验证后离心流程为，当日检测样本原管离心一次2 400 g（3 000 rpm），10 min，离心后样本2 h内完成上机检测（前期性能验证结果显示室温下闭盖保存8 h各点间检测结果间差异无统计学意义）；当日不能检测样本原管离心两次后分装冻存，分装时要求原管血浆层保留1厘米以上，以减少残存血小板对LA检测的影响。
问题8：乏血小板血浆验证要求？
CLSI 2014文件和CAP要求需至少每年或离心机维修后对乏血小板血浆中血小板计数进行验证。行标WS/T 359-2011要求每6个月或在离心机维修后，应验证离心力和离心时间。
本室乏血小板血浆验证每年（安排在离心机年度保养后）或离心机维修后进行一次，包括常规检测区域和急诊区域离心机。验证样本应尽量覆盖血常规血小板计数高值，枸橼酸盐抗凝管离心后先完成血小板计数再上机进行出凝血项目检测。验证记录表示例如下：
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问题9：关于LA实验的质量控制？
LA试剂在进行批号变更时需完成（1）生物参考区间验证，（2）批号间样本比对。
以标准化LA比值进行报告的部分筛选/确证配套试剂，说明书要求在批号变更时重新确定正常血浆均值，以减少试剂批间差对检测结果的影响。
实验室应建立LA检测的室内质控程序，质控品应覆盖阴阳性两个水平。第三方质控品能更好的评估试剂批号变更时是否发生结果偏移。同时，实验室应在能力范围内参加室间质评或进行实验室间比对，保证检测结果的准确性。
问题10：纠正试验（即刻和37度孵育2h）LA都是不纠正的吗？
不一定哦。
此为开放问题，欢迎老师们参与竞答，或给出你们的不同答案。
寿玮龄
北京协和医院检验科
寿玮龄，医学硕士，主管技师。北京协和医院检验科ISO 文件管理组组长，血栓与止血小组技术主管。承担协和医大八年制、协和继教学院出凝血教学及三生带教工作，并发表出凝血相关SCI及核心期刊论著多篇。