张力教授团队：权威揭秘恩沙替尼ALK依赖/非依赖获得性耐药机制！
肿瘤细胞在治疗过程中的不断进化，使治疗药物总不可避免地产生获得性耐药。中山大学肿瘤防治中心张力教授牵头开展了一项II期研究，对第二代ALK抑制剂恩沙替尼治疗克唑替尼治疗后进展的非小细胞肺癌（NSCLC）患者的 循环肿瘤DNA （ctDNA）样本进行了全面的基因组学分析，研究结果近日发表于《JTO》杂志。
揭秘相关药物的获得性耐药机制迫在眉睫
ALK融合见于约5%的NSCLC中，克唑替尼及第二/三代ALK抑制剂明显延长了ALK融合阳性患者的生存时间。但是 由于肿瘤细胞在治疗过程中的不断进化，获得性耐药总是不可避免，追踪肿瘤在治疗过程中的变化，可更好地了解耐药性的发展，从而更好地选择药物，最终有助于优化临床结局。
组织活检被认为是确定实体瘤分子状态的金标准，但是，通过组织活检检测分子状态限制较多。由于空间异质性，单一部位的基因分型往往不能代表整体肿瘤的基因组图谱情况。此外，在治疗过程中，肿瘤的基因组特征也在不断改变。
ctDNA是从肿瘤细胞释放到循环血液中的降解的DNA片段，在大多数实体瘤患者中均可检测到。越来越多的证据表明， ctDNA可成为组织活检的可替代选择，这为预测疗效提供了一种可行方法。有最新研究显示， 与基于单个位点活检相比，ctDNA分析可以更全面地评估基因组特征，并揭示肿瘤内异质性。
中山大学肿瘤防治中心张力教授牵头开展了一项II期研究，对第二代ALK抑制剂恩沙替尼治疗克唑替尼进展的NSCLC患者的ctDNA样本进行了全面的基因组学分析。
研究方法
这是一项在中国27个中心开展的II期临床研究。纳入符合条件的局部晚期或转移性ALK阳性、克唑替尼治疗进展的NSCLC患者，接受恩沙替尼（每日225mg）治疗直至疾病进展或出现不可接受的毒性。基线、第3周期的第1天（C3D1）和疾病进展（PD）时收集可用于ctDNA分析的血液样本，并使用212基因panel进行基因组学分析。
主要结果
01
基线基因图谱及其与临床结局的相关性
基线时，在50.6%（85/168）患者中检测到ALK融合，在28%（47/67）患者中检测到ALK二次突变，其中64例患者的ALK融合突变见于ALK激酶结构域。最常见突变见图1。
图1 基线时基因图谱
值得注意的是，TP53是最常出现的共存突变，见于20.2%（34例）患者。与无TP53突变患者相比，基线TP53突变患者的肝转移发生率更高、肿瘤负荷更大。
PFS分析显示， 与无ALK二次突变患者相比，ALK二次突变患者的PFS更差，ALK突变患者和无ALK突变患者的中位无进展生存期（PFS）分别为4.2个月和13.6个月（P＜0.0001）。TP53突变和无TP53突变患者的中位PFS分别为4.2个月和11.7个月（P＜0.0001）。
单因素分析发现，年龄、肝转移、骨转移、淋巴结转移、肿瘤负荷、ctDNA浓度、突变负荷、TP53突变和ALK二次突变数量可能是PFS预后因素。多因素分析显示，仅淋巴结转移、TP53突变和ALK二次突变数量与PFS明显相关。
不论这些因素如何变化，恩沙替尼的客观缓解率（ORR）均较高：无淋巴结转移和淋巴结转移患者的ORR分别为62.7%和51.3%（P=0.17）；无TP53突变和TP53突变患者的ORR分别为55.2%和52.9%（P=0.811）；无ALK突变和ALK突变患者的ORR分别为57.7%和46.7%（P=0.202）。
02
治疗期间基因图谱变化
在129例发生疾病进展患者中，89.1%（115例）患者在基线、C3D1和PD时均进行了连续ctDNA检测。根据首次检测突变的时间分为三组：基线突变、C3D1新发突变和PD新发突变。
基线时，ctDNA中检测到802例突变。C3D1时，大多数基线时的突变未检测到，并被C3D1新发突变取代：仅86个基线突变仍存在，364个C3D1新发突变。同样，PD时，大多数C3D1新发突变未检测到。
PD时的基因突变包括125个基线突变、20个C3D1新发突变和335个PD新发突变。
基线时，与无TP53突变（4.67±0.39）患者相比，TP53突变（13.79±3.72）患者的突变负荷更高（P＜0.001）。C3D1时，无TP53突变和TP53突变患者的突变负荷均明显下降，但无明显差异，TP53突变和无TP53突变患者的突变负荷分别为5.89±2.25和3.72±0.62（P=0.425）。但是， 与C3D1（5.89±2.25）相比，基线时携带TP53突变患者PD（7.07±1.25）时的突变负荷明显增加（P=0.073）；而基线时无TP53突变患者C3D1（3.72 ± 0.62）和PD（3.20 ± 0.33）时的突变负荷相当（P=0.661）。
PD时，与无TP53突变（3.20 ± 0.33）患者相比，TP53突变（7.07 ± 1.25）患者的突变负荷明显更高（P=0.003）。而且，与无TP53突变患者相比，TP53突变患者ALK二次突变累积发生率明显更高。
研究者还分析了治疗期间ctDNA浓度和肿瘤体积的相关性。研究发现， ctDNA浓度与基线时（P＜0.001）、C3D1（P=0.004）、PD（P＜0.001）时肿瘤体积呈正相关。此外，研究还发现，ctDNA浓度变化与治疗反应具有相关性。与基线时相比，C3D1时91例部分缓解（PR）（P=0.029）和65例疾病稳定（SD）（P=0.038）患者的平均ctDNA浓度 下降了0.3225。与基线时相比，C3D1时9例PD患者的平均ctDNA浓度 增加了1.1986（P=0.051）。C3D1之后，106例发生PD患者的平均ctDNA浓度明显增加了0.1740（P=0.001）。
图2 恩沙替尼治疗期间基因图谱的变化
03
动态ctDNA分析揭示ALK依赖的耐药机制
图3 不同的ALK二次突变
基线时，32.2%患者携带ALK二次突变，包括L1196M（n=12, 10.4%）、G1269A（n= 8, 7.0%）、C1156Y （n=6, 5.2%）、F1174L（n=5,4.3%）和G1202R（n=4, 3.5%）。
C3D1时，14.2%（15/106）患者检测到ALK二次突变，最常见的突变包括G1269A（n =7, 6.6%）和G1202R（n=3, 2.8%）。
PD时，41.7%（48/115）检测到ALK二次突变，最常见的突变包括G1269A（n=23, 20.0%）、G1202R（n = 19, 16.5%）和E1210K（n = 12, 10.4%）。值得注意的是，G1269A、G1202R和E1210K突变是C3D1和PD时最常见的新发突变。研究发现，基线时携带G1269A或G1202R突变患者的PFS更差。
研究者进一步分析了恩沙替尼治疗期间的ALK突变负荷。研究发现，与基线时（0.004885）相比，C3D1时（0.002052）ALK突变丰度明显降低（P=0.001），而 与基线时（0.002052）相比，PD时（0.013076）的ALK突变丰度又明显升高（P＜0.001），甚至超过基线时的基因突变丰度（P=0.001）。
与基线时相比，PD时， G1269A（PD：0.005830 vs 基线：0.001942，P< 0.001）、 G1202R（PD：0.003250 vs 基线：0.000109，P< 0.001）和 E1210K（PD：0.001977 vs 基线：0，P= 0.001） 突变丰度明显升高。相比之下，与基线时相比，PD时， C1156Y（PD：0.000038 vs 基线：0.000648，P=0.028）和 L1152R（PD：0 vs 基线：0.000470，P=0.043） 突变丰度明显降低。
与无TP53突变患者相比，TP53突变患者ALK耐药突变的发生率较高，分别为51.7%和29.1%（P=0.027）。
04
动态ctDNA分析揭示ALK非依赖的耐药机制
为探索ALK非依赖的耐药机制，研究者分析整合了PD时68例无ALK二次突变患者的测序数据，并使用CITUP30推断了不同时间点的肿瘤突变状态。
如图4所示，这些突变涉及 旁路信号通路（GFR1、FGFR3、FLT1），下游效应蛋白激活信号通路（JAK1、MAP2K2、MTOR、PIK3C2A）和间充质转化信号通路（EPHA3、NOTCH1、PTK2、TGFBR2）。值得注意的是，几种突变涉及参与表观遗传学调控（BRD1、DNMT3A、KAT6A、KAT6B、KDM5C、KMT2C、TET2），这表明表观遗传失调也可能在ALK抑制剂耐药中发挥一定作用。
图4 ALK不依赖的获得性耐药机制
讨论和结论
这是迄今为止在ALK阳性NSCLC中进行的最大规模的动态ctDNA分析。
本研究采用连续ctDNA分析监测恩沙替尼治疗过程中肿瘤的进化。研究者首次发现，基线时TP53突变与临床结局较差独立相关。同时研究还揭示了恩沙替尼ALK依赖和不依赖获得性耐药机制。
参考文献：
Yang Y, Huang J, Wang T, Zhou J, Zheng J, Feng J, Zhuang W, Chen J, Zhao J, Zhong W, Zhao Y, Zhang Y, Song Y, Hu Y, Yu Z, Gong Y, Chen Y, Ye F, Zhang S, Cao L, Fan Y, Wu G, Guo Y, Zhou C, Ma K, Fang J, Feng W, Liu Y, Zheng Z, Li G, Wang H, Cang S, Wu N, Song W, Liu X, Zhao S, Ding L, Mao L, Selvaggi G, Zhu L, Xiao S, Yan X, Shen Z, Zhang L. Decoding the Evolutionary Response to Ensartinib in ALK-Positive Non-Small-Cell Lung Cancer Patients by Dynamic Circulating Tumor DNA Sequencing. J Thorac Oncol. 2021 Feb 12:S1556-0864(21)01662-2. doi: 10.1016/j.jtho.2021.01.1615. Epub ahead of print. PMID: 33588113.