免疫荧光技术指南
免疫荧光技术简介
免疫荧光技术是基于荧光基团被特定波长的光激发后发射波长较长的荧光的特性，通过荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等仪器的检测，达到定位、示踪、含量测定等目的，并广泛应用于多个研究领域。荧光染料可以与一抗或二抗直接偶联，也可与链霉素亲和素偶联。主要特点：特异性强，敏感度高，速度快，可进行亚细胞定位的精细观察，可以一次检测多种抗原。
免疫荧光工作原理
样本的制备
荧光抗体技术主要依靠观察切片标本上荧光抗体的染色结果作为抗原的鉴定，因此标本制作的好坏直接影响检测的结果；在制作标本过程中应力求保持抗原的完整性，并在染色、洗涤和包埋过程中不发生溶解和变性，也不扩散至临近细胞或组织间隙中去；标本切片要尽量薄，以利于抗原抗体接触和镜检。
石蜡切片与冰冻切片的对比
冰冻切片制备要点
冰冻切片由于其可以较好的保留酶功能和抗原性，从而广泛的应用于免疫荧光检测中，并且我们通常会在检测一些翻译后修饰的抗原时应用到它，由于其常采用丙酮进行固定，此类固定剂通常不会掩蔽抗原表位，所以不需要像甲醛固定的石蜡切片必须进行抗原修复，从而减去了冗长的实验步骤，也减少了实验失败的几率。
冰冻切片的质量与实验成败息息相关，高质量的切片可以避免实验中组织脱片，减少组织细胞形态的损坏，大大提高了实验结果的可信度。我们要从实验取材开始就做正确的处理方式，尽量减少人为因素对实验结果造成的不确定性。
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选取组织
尽量使用新鲜取材的组织，以使抗原较好的保存下来，降低冻存几率从而减少组织内冰晶的产生；离体组织最好直接进行切片，将组织放在样品托上，滴加OCT包埋剂，选择合适的温度在冰冻切片机中冷冻30min以上，具体时间根据组织大小而定，要保证组织冷冻均匀，不宜时间过长。时间过长，组织会因过度冷冻开裂而导致切片失败。
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制片及常见问题
不同组织所需切片温度不同，要选择最适温度才能获得高质量的冰冻切片。冷冻温度通常在-10℃至-25℃左右，所需温度：心、肾、胃、肠＜脑、脾、肌肉。
切片时一定要保持匀速，切片要平整不能皱缩，其厚度通常为7μm。粘片时应平行的将涂有粘片剂的载玻片贴近组织切片，不要从一侧慢慢地将组织切片吸附到载玻片上，这样会影响组织细胞形态。
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固定及保存
制备好的切片室温放置1 h，晾干后-20℃丙酮中固定20min，切片可以在4℃条件下保存一个月左右，-20℃保存可以适当延长保存时间；建议尽快使用。
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