细胞转染实验注意事项有哪些?

本实验室常用invitrogen的细胞转染试剂:Lipofectamine2000。转染前一天,胰酶消化细胞并计数,细胞铺板,使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清,不含抗生素的正常生长的培养基中。对于每孔细胞,使用50μl无血清培养基(如OPTI-MEMⅠ培养基)稀释0.8μg-1.0μg DNA对于每孔细胞,使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。Lipofectamine2000稀释后保温5分钟(在30分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。)混合稀释的DNA(第2步)和稀释的Lipofectamine 2000(第3步)。在室温保温20分钟。 注意:溶液可能会混浊,但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。直接将复合物加入到每孔中,摇动培养板,轻轻混匀。在加入复合物前移去生长培养基,替换为0.5ml无血清培养基。在37℃,5%的CO2中保温24-48小时,无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。在细胞中加入复合物24-72小时后,分析细胞抽提物或进行原位细胞染色,检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达,在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中,两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。
注意事项:
1.     健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性:通常,健康的细胞转染效率较高。此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验,推荐用50代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随时间明显下降。
2.     通过合适的阳性对照优化转染和检测条件:对大多数细胞,看家基因是较好的阳性对照。或用空载质粒转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。
3.     即使Lipofectamine2000使用OPTI-MEMⅠ稀释,细胞也可以使用D-MEM培养。如果D-MEM做Lipofectamine2000的稀释液,必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
4.     如果在无血清条件下转染,使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。
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