新冠病毒S蛋白中和抗体ELISA半定量检测试剂盒
SARS-CoV-2 S protein Neutralizing Antibody Semi-Quantitative analysis ELISA kit
产品货号：EKnCov001-QT
本说明书版权○CFrdbio
（实验前请仔细阅读产品说明书）
声明：尊敬的客户，感谢您选用本公司的产品。本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断!本试剂盒不含任何具有生物危害成分，但是试剂盒使用过程中涉及的检测样本请在具有相应生物安全防护等级实验室进行，由此可能造成的所有生物安全危害由使用者自行负责。
产品介绍：
2019年低，严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）开始肆虐全球，对全人类生命健康造成巨大威胁。该病毒通过刺突蛋白（Spike protein,S）受体结合域（Receptor Binding Domain,RBD）识别细胞表面受体-血管紧张素转化酶 2（Angiotensin I Converting Enzyme 2,ACE2）并与其结合，在相关蛋白协助和介导下侵染细胞。
本试剂盒可检测的中和抗体为针对S蛋白并且可以阻断其与ACE2结合的抗体；本试剂盒可以检测任何物种体液中针对S蛋白的中和抗体。
本试剂盒预包被酶标板上通过共价固定S蛋白RBD片段，其可以与HRP-ACE2偶联物特异性结合，然后通过TMB在HRP-ACE2偶联物的HRP酶催化下显色；如果待检测样本或者标准品中含有针对S蛋白中和抗体会阻断HRP-ACE2偶联物与固定的RBD片段的结合，因此中和抗体含量与TMB显色值呈负相关。
本试剂盒可检测血清、血浆或其他体液中针对S蛋白的中和抗体，不受待检样品种属和抗体亚型的限制。
虽然本试剂盒中标准品为标准浓度，但是由于不同中和抗体亲和力不同，所以参照本试剂盒标准品测算的中和抗体浓度为相对浓度，因此称为半定量。
试剂盒组成：
组分名称规格保存条件数量
预包被酶标板（共价固定RBD片段）96T-20℃1
中和抗体标准品(S蛋白中和抗体),10ug/ml300ul/支-20℃1
阴性对照品(非相关抗体)30ul/支-20℃1
HRP-ACE2偶联复合物（100×）60ul-20℃1
通用稀释液30ml4℃1
浓缩洗涤液（25×）30ml4℃1
TMB底物液12ml4℃1
底物反应终止液12ml4℃1
酶标板覆膜5
产品说明书1
储存方法：
请按各个组分对应的温度存储，该试剂盒在各组分未拆封的情况下，自生产之日起可存放6个月以上。
试剂准备:
1.从冰箱中取出所有试剂，在使用前平衡至室温（20℃至 25℃）。 未用完后的所有试剂保存在冰箱中。
2.使用前应将所有样品和对照品进行离心。
3.HRP-ACE2工作液：将HRP-ACE2偶联复合物（100×）用 通用稀释液按 1：100进行稀释，即为HRP-ACE2工作液；
4.洗涤液：将 浓缩洗涤液（25×）用 ddH2O 以体积比 1:24 进行稀释（稀释25倍），即为洗涤液。
注意：如浓缩洗涤液（25×）中有沉淀，请在水浴（最高 50℃）中温育、混合至沉淀溶解。
中和抗体标准品、阴性对照品和待检样品的准备
1.将中和抗体标准品用 通用稀释液 做连续2倍倍比稀释，稀释后中和抗体标准品浓度依次为10ug/ml, 5ug/ml, 2.5ug/ml, 1.25ug/ml, 0.625ug/ml, 0.313ug/ml, 0.156ug/ml,
2.阴性对照品用 通用稀释液 以体积比 1:9 进行稀释，即稀释10倍。
例如，50μL 样品加入450μL 通用稀释液。
3.将待检样品用通用稀释液以体积比 1:9 进行稀释，即稀释10倍。
例如，10μL 测试样品加入90μL 通用稀释液。
预包被酶标板准备及加样顺序安排
1. 设置标准品孔、阴性对照品孔和待检样品孔，最好做两个平行重复孔，有条件的可以做三孔平行重复。
2.根据标准品孔、阴性对照品孔和待检样品孔的数量抠取所需酶标板孔条（有条件的可以考虑样品做三次平行重复）。 确保板孔条牢固地卡入板框，未使用的板孔条及时装入有干燥剂铝箔袋密封-20℃保存。
检测操作步骤
1、将稀释好的中和抗体标准品、阴性对照和待检测样品，依次加入酶标板孔，每孔50ul；
加入标准品孔的标准品浓度依次为：10ug/ml, 5ug/ml, 2.5ug/ml, 1.25ug/ml, 0.625ug/ml, 0.313ug/ml, 0.156ug/ml, 阴性对照品
2.以上每孔中再立即加入HRP-ACE2工作液，每孔50ul,加完后震荡仪轻轻混匀；
3.用酶标板膜覆封盖板孔，在 37℃ 下孵育 60 分钟；
4.取下平板密封膜，用 350μL 的 洗涤液 洗涤酶标板孔 3 次；
5.洗涤完毕后在吸水纸上拍干孔内液体；
6.每孔立即加入100uL TMB底物液，室温显色10-15分钟，待其显色稳定后立即在每孔加入50uL底物反应终止液
吸光值读取：
提前10分钟打开酶标仪，待其预热稳定后方可使用。
将显色反应终止的酶标板放入酶标仪，设定好检测波长450nm(最好设置双波长：以450nm为吸光波长， 630nm为参考波长)；
TMB底物反应时间与温度有关，比较适宜温度为25℃左右；温度太低，反应速度慢，温度高，背景较深，边缘效应严重。
待测样品中和抗体浓度计算：
通过标准品浓度及其对应OD值建立标准品曲线，将待检样品OD值代入拟合曲线公式计算待检样品中中和抗体浓度。
1.可以使用Curve Expert绘制标准曲线，并且通过其拟合曲线公式进行样品浓度计算；
2.当检测样品OD值或者标准品OD值高于阴性对照品OD值时，应该予以舍弃，不予纳入计算，此可能为样品个体差异所引起的干扰。试剂盒所使用的通用稀释液为标准稀释液，与复杂的体液环境还是有一定差异，所以只有OD值低于阴性对照品的OD值才纳入计算范围。
典型数据：
中和抗体标准品10ug/ml5ug/ml2.5ug/ml1.25ug/ml0.625ug/ml0.313ug/ml0.156ug/ml阴性对照品
OD4500.0780.1020.2890.4751.1101.5651.9062.015
*本试剂仅供实验室研究使用