一文读懂生物界中的“快递小王子”：间充质干细胞外泌体
本文首发自博雅干细胞
作者：华南农业大学 Timer
专家审核：江苏大学附属医院 李晶 教授
近年来，已经有许多研究表明了间充质干细胞在再生医学领域中具有广阔的应用前景，同时国际上也已经有干细胞新药获批上市。除了干细胞本身，源自于干细胞的外泌体也成为了医学届关注的热点，为疾病的治疗带来了新思路。例如，间充质干细胞外泌体已经被广泛应用到了多种疾病的临床治疗研究中，包括新冠肺炎、阿尔兹海默症、子宫内膜损伤等疾病。
那么，间充质干细胞外泌体是什么？它具有怎样的生物学特性，如何获取？在疾病治疗中发挥着怎样的作用？本文将为您揭晓。
外泌体：细胞之间的“快递小王子”
外泌体在20世纪80年代首次被发现以来，就引起了国内外众多研究学者的关注。1983年，外泌体首次被发现存在于大鼠的网织红细胞中[1]；2007年研究者首次在外泌体中发现了microRNA和mRNA等遗传物质，这也意味着外泌体可能是细胞之间传递信息物质的新途径[2]；2013年诺贝尔生理学或医学奖授予共同发现外泌体囊泡准确转运物质的调控机制的三位科学家。
图片来源：文献[3]
外泌体就是囊泡的一种，它的存在就像是细胞之间的“快递小王子”。现代社会的经济发展离不开物流业，同样的，人体的新陈代谢也离不开细胞间的信息物质交流，外泌体正是交流信息、交换物质的载体。
对外泌体的定义是：细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程形成的直径40-100nm的膜性脂质小囊泡，可通过外泌体进行运输功能性蛋白质、mRNA、microRNA等物质[3]。
那么，这个“快递小王子”是如何与“目标”进行交流的呢？
主要有两种途径，一是通过胞吞作用被摄入到细胞内；二是通过膜融合的方式与靶细胞膜融合，然后直接释放其中含有的物质以及信息至靶标细胞。外泌体的作用形式是相互的。靶细胞分泌含有细胞特异性RNA的外泌体作用于周围细胞后可诱导其表型重组而获得组织特异性的表型；周围细胞分泌的外泌体可以通过调控蛋白表达，从而调控细胞的生理过程[4]。
如何获取和甄别外泌体？
现如今，外泌体的分离方法有超速离心法、磁珠免疫捕获法、聚合沉淀法、超滤法、凝胶色谱法等几种方法。
超速离心法：通过逐步提高离心速度去除细胞上清中的细胞碎片和蛋白质沉淀后得到外泌体。需要8-30小时，最多只能同时处理6个样品，产量低，步骤较为繁琐。
聚合沉淀：操作简单，不需要过多设备，但容易受污染。
超滤法：超滤法是利用小孔径的超滤膜离心分离外泌体，先低速离心去除上清液细胞碎片和蛋白质沉淀，然后通过离心就可以得到外泌体，该方法简单、省时，能够保证外泌体结构的完整性，但是会牺牲一部分的纯度。
磁珠免疫捕获法：通过使用外泌体表面特有的表面标记物使得外泌体分离出来，具有特异性高，操作方便等优点，但是效率低，分离出来的外泌体容易受到PH值和盐浓度影响。
凝胶色谱法：此方法是先将培养基上清通过滤膜去除大分子蛋白质，然后将滤液通过排阻色谱，大分子物质会被洗脱下来，最后得到外泌体。此方法操作费时，过程较为复杂。
分离之后，可以通过外泌体的物理特征进行甄别，外泌体直径在40-100nm之间，因此可通过电子显微镜等方法进行直接地观察。其次，间充质干细胞外泌体有自己的表面标志物如CD81、CD9等，这些可以通过微流式细胞分析仪、免疫印迹分析、酶联免疫吸附试验进行分析鉴定。
外泌体在疾病治疗中发挥怎样的作用？
研究发现，间充质干细胞外泌体具有分化潜能高、移植后存活率高、无明显不良反应等优点，且含有大量且种类繁多的蛋白质、细胞因子和生物活性物质。在抗心肌细胞凋亡、抗心肌细胞损伤、促进新生血管形成和抗炎等方面具有重要作用。在防治急性心肌梗死、高血压、心力衰竭和心肌病等方面具有一定的应用前景。
肾功能损伤的恢复：研究者发现外泌体运载的mRNA通过促进固有肾小管上皮细胞增殖，抑制存活细胞的凋亡，从而使得缺血再灌注急性肾损伤大鼠恢复机体功能[5 ]。试验证明了间充质干细胞外泌体能够显著有效减少肾功能损伤，其主要是通过间充质干细胞外泌体中的RNA酶灭活RNA。
改善心肌功能：最近发表的一项研究表明[6]，间充质干细胞外泌体能够显著改善心肌功能，降低心肌纤维化程度。研究团队使用了大鼠进行研究，分为正常组与治疗组，按照剂量分别对大鼠注射外泌体，结果显示治疗组的左心室射血分数与左心室短轴缩短率与正常组比较都有显著降低；左心室舒张末期内径与左心室收缩末期内径与正常组相比都有明显增加。研究发现可能是间充质干细胞外泌体在伤口愈合中可通过抑制转化生长因子β1（TGF-β1）/Samd2途径而减少瘢痕的形成。
图片来源：文献[6]
外泌体治疗后各组大鼠心室肌的Masson染色(×200) A：正常组；B：扩张型心肌病组；C：外泌体低剂量组；D：外泌体中剂量组；E：外泌体高剂量组
2015年的一项研究[7]发现，间充质干细胞源性外泌体移植后能显著提高心肌细胞的存活率，并能抗心肌细胞损伤，促进新生血管形成，改善心脏功能。
皮肤修复：近年来，研究人员将外泌体与皮肤疾病联系起来，发现外泌体不仅参与皮肤生理、病理过程，如调节皮肤微环境中促炎细胞因子分泌，促进皮肤缺损处血管新生及胶原沉积，以及调节皮肤成纤维细胞增殖分化，同时还在皮肤微环境发生病变时发挥特异性信息传递作用。
2015年发表的研究发现，间充质干细胞外泌体中含有丰富的Wnt蛋白，能活化β-catenin信号通路，同时通过激活Erk1/2信号通路正调控成血管基因——VEGFA、Cox-2、FGF2等的表达，进而促进了二度烧伤大鼠模型深部创伤后血管的重生、胶原蛋白合成和皮肤损伤修复[8]。
结语
间充质干细胞外泌体已经被证实在多个领域中具有广阔的应用前景。未来仍需开展进一步的探索，包括建立有效可行的制备方法以及应用方式。外泌体与细胞不一样，它的特点是更加灵活，更加容易改造，因此外泌体可作为疾病治疗研究的新方向。我们期待科研工作者产生更多的研究成果。
参考文献：
【1】Harding C, Heuser J, Stahl P. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. J Cell Biol. 1983;97(2):329-339. doi:10.1083/jcb.97.2.329|https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/6309857/
【2】Jin-Ok, Jeong, Ji,. Malignant tumor formation after transplantation of short-term cultured bone marrow mesenchymal stem cells in experimental myocardial infarction and diabetic neuropathy.[J]. Circulation Research, 2011.|https://www.ahajournals.org/doi/pdf/10.1161/circresaha.110.239848
【3】Breakefield XO, Frederickson RM, Simpson RJ. Gesicles: Microvesicle "cookies" for transient information transfer between cells. Mol Ther. 2011;19(9):1574-1576. doi:10.1038/mt.2011.169 |https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3182359/
【4】Corrado C, Raimondo S, Chiesi A, Ciccia F, De Leo G, Alessandro R. Exosomes as intercellular signaling organelles involved in health and disease: basic science and clinical applications. Int J Mol Sci. 2013;14(3):5338-5366. Published 2013 Mar 6. doi:10.3390/ijms14035338|https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23466882/
【5】Gatti S, Bruno S, Deregibus MC, et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant. 2011;26(5):1474-1483. doi:10.1093/ndt/gfr015 |https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21324974/
【6】柳爽爽, 王本臻, 毛成刚, et al. 人脐带间充质干细胞外泌体对多柔比星致扩张型心肌病大鼠心肌纤维化的影响[J]. 中华实用儿科临床杂志, 2020, 35(11):842-846.| http://rs.yiigle.com/CN101070202011/1205430.htm
【7】Embryonic Stem Cell-Derived Exosomes Promote Endogenous Repair Mechanisms and Enhance Cardiac Function Following Myocardial Infarction.
【8】Zhang B, Wang M, Gong A, et al. 2015. HucMSC-exosome mediated-Wnt4 signaling is required for cutaneous wound healing.Stem Cells, 33: 2158-2168
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