Caspase酶抑制剂，可逆不可逆？
什么是胱天蛋白酶？胱天蛋白酶（Caspases）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，它们是为细胞凋亡的主要介质。多种受体，例如TNF-α 受体，FasL受体，TLR和死亡受体，以及Bcl-2和凋亡抑制剂（IAP）蛋白家族参与并调节该caspase依赖性凋亡途径。一旦Caspase受到上游信号（外部或内在）刺激被激活，即会参与执行下游蛋白底物的水解作用，并触发一系列事件，导致细胞分解，死亡，吞噬作用和细胞碎片的清除。人Caspases酶人的Caspases家族基于序列相似性和生物学功能等共性主要可分为三大类：类由具有长胱天蛋白酶募集结构域的“炎症”胱天蛋白酶组成，他们对P4位上的较大的芳香族或疏水性残基具有亲和力。第二类由具有短的前体结构域的“细胞凋亡效应”胱天蛋白酶组成，而第三类由具有长的前提结构域的Pap位置具有亮氨酸或缬氨酸底物亲和力的“凋亡引发剂”胱天蛋白酶组成（表1）。表1. 人胱天蛋白酶的功能分类：细胞死亡途径半胱天冬酶类型酵素物种细胞凋亡启动器Caspases 2人与鼠细胞凋亡启动器Caspases 8人与鼠细胞凋亡启动器Caspases 9人与鼠细胞凋亡启动器Caspases 10人的细胞凋亡效应器Caspases 3人与鼠细胞凋亡效应器Caspases 6人与鼠细胞凋亡效应器Caspases 6人与鼠细胞焦亡炎性的Caspases 1人与鼠细胞焦亡炎性的Caspases 4人的细胞焦亡炎性的Caspases 5人的启动器Caspase和效应器Caspase酶根据其在凋亡胱天蛋白酶途径中的作用，胱天蛋白酶可分为两类：启动器和效应器Caspase酶。启动器和效应器Caspas酶都具有由小亚基和大亚基组成的催化位点，Caspase酶的识别位
凋亡启动器Caspase酶，例如caspase-2，-8，-9和-10可以启动caspase激活级联反应。Caspase-8对于形成死亡诱导信号复合物（DISC）是必不可少的，并且在激活后，Caspase-8激活下游效应子Caspase（例如Caspase 3）并介导线粒体中细胞色素c的释放。Caspase-8已被证明对IETD肽序列具有相对较高的底物选择性。凋亡效应胱天蛋白酶例如Caspase-3，-6和-7虽然不负责启动级联途径，但是当被激活时，它们在级联的中间和后续步骤中起着不可或缺的作用。Caspase-3（CPP32 / apopain）是关键效应器，因为它放大了来自启动器Caspase的信号，使用对Caspase-3有选择性的DEVD肽序列对活化的Caspase-3进行检测，可以检测Caspase-3的活性。Caspase酶底物和抑制剂Caspase底物和抑制剂由两个关键成分组成：Caspase识别序列和信号产生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase识别序列不同，一般由三个或四个氨基酸组成（表2）。Caspase酶识别序列的N端通常有乙酰基（Ac）或碳苯甲氧基（Z）基团修饰，以增强膜的通透性。对应的Caspase识别特定的肽序列为其酶促反应切割位点，释放产生信号或抑制信号的基序。Caspase的显色和荧光底物均以相似的方式起作用，其中底物的信号或颜色强度与蛋白水解活性成正比。表2. Caspase的底物及其序列多肽氨基酸序列对应的Caspase的种类IETDIle-Glu-Thr-AspCaspase 8，颗粒酶BDEVDAsp-Glu-Val-AspCaspase 3、6、7、8或10LEHDLeu-Glu-His-AspCaspase 9VADVal-Ala-AspCaspase 1、2、3、6、8、9或10Caspase酶的显色底物Caspase的显色底物是有Caspase识别序列及生色基团组成，常见的生色团有pNA（对硝基苯胺或4-硝基苯胺），可使用酶标仪或分光光度计在405 nm处进行光密度检测。表3. Caspase的显色底物底物Caspase吸收（nm）颜色Ac-DEVD-pNA * CAS 189950-66-1 *半胱天冬酶3405 nm黄色Z-DEVD-pNA半胱天冬酶3405 nm黄色Z-IETD-pNA * CAS 219138-21-3 *半胱天冬酶8，颗粒酶B405 nm黄色Caspase的荧光底物Caspase的荧光底物的结构包含与半胱天冬酶识别相关的荧光团，例如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC）， Rhodamine 110（R110）或ProRed™620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物（例如AMC和AFC）更敏感，但由于两步裂解过程，其动态范围更窄。 建议将R110标记的Caspase底物用于终点法测定，而将AMC和AFC标记的 Caspase底物用于动力学测定。
图.从左到右，分别是AMC（7-氨基-4-甲基香豆素），AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素），Rhodamine 110（R110）和ProRed™620的激发和发射光谱。表4.荧光半胱天冬酶底物底物名称对应的CaspaseEx（nm）Em（nm）ε¹Φ²Ac-DEVD-AFC * CAS 201608-14-2 *半胱天冬酶3、7376482170000.53Ac-DEVD-AMC * CAS 169332-61-0 *半胱天冬酶3、734144119000N / DZ-DEVD-AFC半胱天冬酶3、7376482170000.53Z-DEVD-AMC * CAS 1135416-11-3 *半胱天冬酶3、734144119000N / DZ-DEVD-ProRed™620半胱天冬酶3、7532619N / DN / D（Z-DEVD）2 -R110 * CAS 223538-61-2 *半胱天冬酶3、750052280000N / DZ-DEVD-ProRed™620半胱天冬酶3、7532619N / DN / DAc-IETD-AFC * CAS 211990-57-7 *半胱天冬酶8，颗粒酶B376482170000.53交流电-IETD-AMC半胱天冬酶8，颗粒酶B34144119000N / DZ-IETD-AFC * CAS 219138-02-0 *半胱天冬酶8，颗粒酶B376482170000.53注意：1.ε=在其zui大吸收波长处的摩尔消光系数（单位= cm -1M -1）。2.Φ=水性缓冲液（pH 7.2）中的荧光量子产率。Caspase抑制剂Caspase抑制剂能与Caspase的活性位点结合并形成可逆或不可逆的连接，通常，Caspase抑制剂的结构由Caspase识别序列，诸如醛（-CHO）或氟甲基酮（-FMK）的官能团组成。具有醛官能团的胱天蛋白酶抑制剂是可逆的，而具有FMK的抑制剂是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制剂都具有较小的细胞毒性作用，因此，它们是研究半胱天冬酶活性的有用工具。表5. 可逆和不可逆的Caspase酶抑制剂抑制剂Caspase的种类是否可逆Ex（nm）Em（nm）Ac-DEVD-CHO * CAS 169332-60-9 *半胱天冬酶3、7可逆的----Ac-IETD-CHO * CAS 191338-86-0 *半胱天冬酶8可逆的----mFluor™450-VAD-FMK半胱天冬酶1，2，3，6，8，9，10不可逆的406445mFluor™510-VAD-FMK半胱天冬酶1，2，3，6，8，9，10不可逆的412505FITC-C6-DEVD-FMK半胱天冬酶3、7不可逆的491516FITC-C6-DEVD-FMK半胱天冬酶3、7不可逆的491516FITC-C6-LEHD-FMK半胱天冬酶9不可逆的491516FITC-C6-LEHD-FMK半胱天冬酶9不可逆的491516FAM-VAD-FMK半胱天冬酶1，2，3，6，8，9，10不可逆的493517SRB-VAD-FMK [磺胺丁胺B-VAD-FMK]半胱天冬酶1，2，3，6，8，9，10不可逆的559577