易基因 | 全面的表观基因组图谱揭示了DNA甲基化调节骨骼肌发育的机制
文献速递 | 全面的表观基因组图谱揭示了DNA甲基化调节骨骼肌发育的机制
大家好，易基因文献科普栏目又来啦！今天要分享解读一篇发表于Nucleic Acids Research（IF16.971）的DNA甲基化研究文章，本文通过WGBS-seq和RNA-seq描述了猪骨骼肌27个发育阶段的首个单碱基分辨率DNA甲基化组和转录组图谱，并进一步揭示了DNA甲基化调节骨骼肌发育的机制。
期刊介绍：
Nucleic Acids Research ( NAR )： NAR发表涉及核酸代谢和/或相互作用的核酸和蛋白质的物理、化学、生化和生物学方面的前沿研究结果。每年的第一期专门介绍生物数据库，7月份的一期专门介绍对生物群落有价值的基于网络的软件资源的论文，NAR长期居于JCR一区，属于高水平领头羊杂志。
关于WGBS
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。
常规全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。
标题：A comprehensive epigenome atlas reveals DNA methylation regulating skeletal muscle development
期刊：Nucleic Acids Research ( NAR )
2021影响因子: IF 16.971
发表时间：2021.1.12
技术平台：WGBS-seq，RNA-seq
1、研究目的：
DNA甲基化在哺乳动物发育过程中起着至关重要的作用。然而，关于全基因组DNA甲基化在骨骼肌发育中的动态调控还知之甚少。因此，我们描述了猪骨骼肌27个发育阶段的首个单碱基分辨率DNA甲基化组和转录组图谱。此外，我们还鉴定了超过40000个发育差异甲基化CPG(dDMCs)，它们重构了骨骼肌的发育轨迹，并与肌肉发育基因和转录因子(TFs)相关，表明了DNA甲基化在骨骼肌发育和生长过程中的潜在生物学功能。
2、项目设计：
2.1 样本选取：
骨骼肌(longissimus dorsi)样本来自长白猪的27个发育阶段,包括胚胎33天,40天,45天,50天,55天,60天,65天,70天,75天,80天,85天,90天,95天,100天和105天(缩写为E33, E40、E45 E50, E55, E60, E65, E70, E75, E80, E85, E90, E95,E100和E105)和产后0天,9天,20天、30天、40天,60天,80天,100天,120天,140天, 160天和180天(缩写为D0, D9, D20, D30, D40, D60, D80, D100, D120, D140, D160和D180)。在每个阶段，分别采集3头猪的骨骼肌作为生物学重复。
2.2 项目设计流程图：
3.实验结果
3.1 DNA甲基化组和转录组动态图谱
我们在骨骼肌基因组中鉴定出105个低甲基化区域，包含115个基因。有趣的是，近一半(53/115)的基因是在转录调控中发挥核心作用的TFs。我们以所有蛋白编码基因为背景进行超几何检测，发现HMRs中显著富集TFs。此外，位于HMRs的TFs包含更多和更长的CpGIs，但HMRs中的基因和TFs的表达水平低于不含HMRs的基因和TFs，表明HMRs抑制骨骼肌中TFs的表达。
3.2 骨骼肌发育过程中的DNA甲基组动力学
CpG甲基化水平产前明显高于产后骨骼肌。在DNA甲基转移酶中，DNMT1和UHRF1表达量最高。此外，我们观察到基因组区域平均DNA甲基化水平的降低，这被定义为PMD。在骨骼肌发育过程中，PMD在基因组中的位置高度保守，其基因表达水平始终低于PMD之外的基因，表明PMD在骨骼肌中广泛存在并受到抑制，并且在骨骼肌发育过程中PMD的增加与整体DNA甲基化水平和转录活性的降低高度相关。
3.3骨骼肌中的DNA甲基化性别偏倚
性别对全基因组或常染色体的整体DNA甲基化方面没有显著差异。然而，在X染色体上，雄性猪的DNA甲基化水平高于雌性猪。利用多元线性回归模型共鉴定出雌性和雄性猪之间2,0244个显著差异的CPG。几乎所有性别偏倚的CpG都位于X染色体上，雄性的性别偏倚CpG位点甲基化水平显著高于雌性，因此，基于性别偏倚CpGs的MDS分析提示骨骼肌明显按性别和发育阶段分离。
3.4发育差异甲基化CPG与骨骼肌发育相关
我们确定了在骨骼肌发育过程中具有显著变化的CpG，称为发育差异甲基化CpG位点(dDMCs)。使用多元线性回归模型，共鉴定出47 872个常染色体dDMC。此外，基于dDMCs甲基化的MDS分析准确重构了骨骼肌的发育轨迹。骨骼肌按发育阶段排列，呈典型的倒V形，与MDS转录组分析结果相似。此外，这些dDMC被聚成12个共甲基化模块，每个模块至少包含500个CPG，这些模块在骨骼肌发育过程中表现出类似的DNA甲基化动力学,它们的甲基化水平清晰地将骨骼肌划分到了不同的发育阶段，表明dDMC可以作为一个表观遗传时钟来估计发育年龄。
3.5 dDMC在骨骼肌发育中的功能意义
我们从基因本体论(http://wiki.geneontology.org/index.php/Muscle biology)中提取了172个与肌肉发育和功能注释相关的基因，发现这些肌肉相关基因附近的dDMC比基因组中随机基因附近的dDMC更丰富。随后，我们进一步鉴定了dDMCs周围富集的TF结合基序，发现启动子dDMCs高度富集了骨骼肌生成TFs的结合基序。
3.6 骨骼肌发育过程中DNA甲基化与基因表达的关系
我们将骨骼肌发育过程中基因按表达水平分为高、中、低和无表达四组，发现高表达基因伴随着低DNA甲基化水平的上游TSS，调控的程度明显与距离TSS的距离有关。此外，5-Aza诱导去甲基化后，PPP1R3A、PYGM和PRKAA3 mRNA表达水平及乳酸含量均显著上调。western blot结果还表明，胰岛素信号通路关键节点蛋白AKT和IR的磷酸化水平显著升高，提示DNA甲基化抑制了骨骼肌发生过程中胰岛素信号通路的激活。
3.7 DNA甲基化通过调节SP1在骨骼肌中的结合来调节IGF2BP3
胰岛素样生长因子2结合蛋白3 (IGF2BP3)是SP1的靶标，是骨骼肌发育过程中启动子甲基化增加与mRNA表达降低相关的最热门候选基因。在骨骼肌发育过程中，SP1和IGF2BP3的表达水平显著正相关。此外，在C2C12成肌细胞分化过程中，SP1和IGF2BP3的表达水平一致降低。ChIP-qPCR进一步证实SP1可与IGF2BP3启动子直接相互作用，5-Aza诱导去甲基化后，结合活性增强。在功能上，IGF2BP3基因的敲除显著延迟了C2C12成肌细胞的分化和增殖，而5- aza基因的去甲基化和SP1基因的过表达促进了分化和增殖。综上所述， DNA甲基化通过调节SP1在肌发生中的结合来调控IGF2BP3的表达和功能。
4、关键图形
Figure 3. Identification of developmentally differentially methylated CpG sites (dDMCs) in skeletal muscle.
Figure 5. Association between DNA methylation and gene expression.
易基因小结
这可能是迄今为止猪骨骼肌发育过程中最全面的 DNA 甲基化研究。研究强调了DNA甲基化在骨骼肌发育中的功能和调节作用，揭示了骨骼肌发育和生长过程中 DNA 甲基化的潜在生物学功能。这些数据对于了解哺乳动物骨骼肌发育的分子调控具有重要价值，为动物育种、肌肉生物学及相关疾病研究提供了宝贵的资源参考。展望未来，将这些数据与用于靶向 DNA 甲基化、单细胞测序和其他表观遗传修饰（如 RNA 编辑、m 6 A 甲基化和组蛋白修饰）的表观遗传编辑工具整合提供有力的支持。
文献来源：/doi.org/10.1093/nar/gkaa1203
原文解读：