2006-自然研究-从小鼠肝脏、肌肉和培养成纤维细胞中分离功能性线粒体的细胞器 2006-Nature Protocols-Organelle isolation functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts（翻译）
Introduction
线粒体是控制细胞生死的中央细胞器。它们参与关键的代谢反应，合成大部分ATP，调控包括凋亡在内的一系列信号级联反应。
在早期的核心生物能学中，人们热衷于研究能量守恒的机制，线粒体研究得益于从组织中分离的细胞器的制备。这要归功于George Palade及其同事的开创性工作，他们在20世纪40年代末开发了一种基于差异离心的分离线粒体的方案。他们建立在Bensley和Hoerr3的早期工作的基础上，他们通过离心从冷冻解冻的豚鼠肝脏中分离出一种混合的膜状碎片，这种碎片可能富含线粒体。Palade的直觉是，在机械均质组织后，根据细胞的不同沉降特性，应用差异离心来分离细胞成分。这种方法是对线粒体研究的一次真正的哥白尼式革命，允许高产分离纯细胞器。结果，在接下来的20年里，我们看到了如此惊人的发现:能源节约的机理;线粒体dna5,6的鉴定及线粒体前体蛋白导入的鉴定线粒体超微结构的定义，随着Palade模型的发展;最后但并非最不重要的是，发现了线粒体内膜通道。
在线粒体离开生物医学研究的中心阶段近15年之后，在20世纪90年代，线粒体重新获得了重大研究成果，因为发现它们通过释放细胞色素c和其他膜间隙蛋白来放大细胞凋亡，而这些蛋白需要充分激活效应caspases10,11。虽然线粒体在细胞凋亡中起着至关重要的作用，但细胞色素c释放的确切机制仍然是一个激烈争论和研究的问题。此外，越来越多的证据表明该细胞器在多个病理生理过程中的作用，包括神经退化、神经元形态发生、可塑性和不育。这些发现，加上新旧研究领域的结果，旨在阐明线粒体功能的基本生物学机制。从代谢物和离子的运输，到蛋白质导入的机制和蛋白质的阐明，再到线粒体的动态行为，所有这些领域都从分离的、纯细胞器的可用性中受益匪浅。
本协议描述了如何从肝脏、骨骼肌和培养细胞三种不同来源获得功能性、纯化、完整的线粒体。这些变异旨在作为例证，而不是详尽无遗的，因为它们没有涵盖可以分离出线粒体的不同来源。例如，酵母细胞中线粒体的分离是根据这些低等真核生物的机械和渗透特性量身定制的。由于我们的目的是为不同的器官和培养的细胞提供一个总体框架，在任何情况下都可以由单个研究人员修改，严格遵循这些协议最适合于从所描述的组织和细胞中分离细胞器。然而，我们的经验表明，与成纤维细胞一起使用的方案可以不经修饰而采用，从其他细胞系，如HeLa和前列腺癌细胞系LnCaP中分离线粒体。另一方面，将线粒体从肌肉和肝脏以外的器官中分离出来的方法与这里所描述的不同。因此，我们强烈建议读者参考已发表的针对大脑、棕色脂肪组织和心脏的治疗方案。
应该强调的是，可用于分离线粒体的方案与我们的方案有些不同，特别是在差速离心步骤的速度和分离缓冲液中用作渗透压调节剂的糖方面。根据我们的经验，沉降速度的微小变化(600与800g，7，000与8，000g)不会影响线粒体制剂的质量和产量，但据报道，使用甘露醇等单糖可使分离的线粒体更好地偶联23，24。根据我们的经验，使用甘露醇并未改善线粒体制剂的质量。如果读者发现使用我们的方案分离的线粒体的质量或产量不令人满意，建议尝试用甘露醇等单糖替代蔗糖。线粒体分离的最终目标是获得尽可能纯净和有功能的细胞器。我们强烈建议，特别是如果将线粒体用于功能测定(如细胞色素c的释放、线粒体融合、蛋白质导入和活性氧的产生)，应始终使用氧电极测量制剂的偶联。因此，这些方案以如何测量线粒体呼吸以确定制剂质量的描述结束。偶联良好的线粒体是在旨在研究线粒体参与复杂生物现象机制的测定中获得可靠、可再现结果的第一步。
总之，这些方案是从组织和细胞中获得纯线粒体的一个有价值的起点。然后，分离的线粒体可用于研究细胞器的功能、对凋亡刺激的反应、细胞色素c释放的特征、蛋白质导入以及线粒体生物学和病理生理学中需要纯细胞器和功能性细胞器来源的许多其他方面。
MATERIALS
REAGENTS
材料和试剂。
从小鼠中分离的目的细胞系或肝脏或肌肉。具有所需遗传背景的小鼠(Charles River或Jackson Laboratories)。
不含Ca2+和Mg2+的Dulbecco s磷酸盐缓冲盐水(PBS，Invitrogen，cat. no. 14200-067)。
蔗糖(Sigma, cat. no. 84100)。
磷酸二氢钾(Pi, Sigma, cat. no. P53799)。
sigma 7-9(Tris, Sigma, cat. no. T1378)。
4-吗啉代丙磺酸(MOPS; Sigma, cat. no. M1254)。
乙二胺四乙酸二钠二水合物(EDTA; Sigma, cat. no. ED2SS)。
乙烯-双(氧乙烯腈)四乙酸(EGTA; Sigma, cat. no. E4378)。
氯化钾(Baker, cat. no. 0208)。
氯化镁六水合物(Sigma, cat. no. M9272)。
牛血清白蛋白(BSA)；BSA; Sigma, cat. no. A6003)。
Dulbecco改良的Eagle培养基(Invitrogen, cat. no. 11971025)。
200mM L-谷氨酰胺(Invitrogen, cat. no. 25030024)。
胎牛血清(Invitrogen, cat. no. 10270106)。
5，000 U·ml 1青霉素/5，000mg·ml 1链霉素(Invitrogen, cat. no. 15070063)。
10 mM基本必需培养基非必需氨基酸溶液(Invitrogen, cat. no. 11140)。
0.25% (w/v)胰蛋白酶EDTA溶液(Invitrogen, cat. no. 25200072)。
腺苷5-二磷酸钠盐(ADP; Sigma, cat. no. A2754)。
羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯基腙(FCCP; Sigma, cat. no. C2920)。
谷氨酸(Sigma, cat. no. 27647)。
苹果酸(Sigma, cat. no. M1000)。
琥珀酸(Sigma, cat. no. S3674)。
鱼藤酮(Sigma, cat. no. R8875)。
l-抗坏血酸(Sigma, cat. no. 255564)。
N，N，N，N-四甲基-对苯二胺二盐酸盐(TMPD; Sigma, cat. no. T3134)。
抗霉素A(Sigma, cat. no. A8674)
EQUIPMENT
用于细胞培养的. 500 cm2培养皿(Nunclon, cat. no. 16 6508)。
18cm细胞刮除器(Falcon, cat. no. 353085)。
电机驱动的紧密配合玻璃/特氟隆波特埃尔维耶姆均质机(图1)。
克拉克型氧电极(Hansatech Oxygraph; Fig. 2)。
50 ml聚丙烯Falcon管。
14 ml聚丙烯Falcon管。
1.5 ml微量离心试管。
30 ml圆底玻璃离心管(Kimble, cat. no. 45500-30)。
离心管的橡胶适配器套管(Kimble, cat. no. 45500-15)。
冷藏离心机，含50 ml Falcon试管和玻璃离心试管。
Hamilton注射器:10 ml (Hamilton, cat. no. 701 N)和50 ml (Hamilton cat. no. 705 N)
REAGENT SETUP
试剂的设置
细胞培养基使用为您喜爱的细胞系推荐的培养基。对于本方案中提及的细胞系，使用添加了10%(v/v)胎牛血清0.1 mM的Dulbecco改良Eagle培养基基本必需培养基非必需氨基酸。分别为2mM L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素50 U ml-I和50 ug ml-I细胞进行实验前两天或三天，将细胞置于500 cm组织培养皿中。每个平板使用70 ml细胞培养基
为了获得高产的分离线粒体，确保细胞在培养皿上完全分散是至关重要的，在实验当天达到几乎100%的汇合是至关重要的。
1 M蔗糖：将342.3 g蔗糖溶于1升蒸馏水中；充分混合并制备20毫升等分试样；
0.1 M Tris/MOPS：将12.1 g Tris溶解在500 ml蒸馏水中，使用MOPS粉末将pH调至7.4，将溶液调至1升，在4 1C下储存。
1 M Tris/HCl：将121.14 g Tris溶于500 ml蒸馏水中，用盐酸将pH调至7.4;将溶液调至1升并在室温下储存。
0.1 M EGTA/Tris：将38.1 g EGTA溶解在500 ml蒸馏水中，用Tris粉将pH调至7.4，将溶液调至1升，在4 ℃下储存。
0.5 M MgCl2：将101.7 g MgCl2溶于1升蒸馏水中，置于4 ℃下储存。
1 M KCl：将74.6克氯化钾溶解在1升蒸馏水中，并在4℃下储存。
1 M EDTA：将372.2 g EDTA溶解在500 ml蒸馏水中，用Tris粉将pH调至7.4，将溶液调至1升，在4 ℃下储存。
10% BSA：将10g BSA溶于100 ml蒸馏水中，并在-20 ℃储存。
1 M Pi：将136.1克磷酸氢钾溶解在500毫升蒸馏水中，用Tris粉调整pH至7.4，将溶液调至1升，在4 ℃下储存
10 mM ADP：将4.7mg ADP溶于1 ml蒸馏水中。将酸碱度调节至7.4制备100 ml等分试样，并在-20 ℃避光保存6个月。
20 mM FCCP：将5.1 mg FCCP溶解于1 ml无水乙醇中。溶液的颜色是淡黄色。存储在-20 ℃。使用前，在2ml无水乙醇中加入10ul的20mM FCCP将原溶液稀释至100uM。
图1 | Glass/Teflon Potter Elvehjem均质器。左边的均质器(5ml)最适合从细胞中分离线粒体，右边的均质器(30ml)更适合从组织中分离线粒体。
图2 | 一个clark型氧电极连接到笔记本电脑和一个水浴。屏幕上的痕迹与拍摄照片时实验运行的记录相对应。
0.25 M谷氨酸/0.125 M苹果酸：将9.2 g谷氨酸和4.2 g苹果酸溶解于100ml蒸馏水中。调整pH值至7。4 .用Tris碱实现盐的完全溶解。加水至250毫升，准备10毫升等量，在C中保存6个月。
0.5 M琥珀酸原液(100X)：将3.0 g琥珀酸溶解于30ml蒸馏水中。用Tris碱调整pH值，使盐完全溶解。加水使体积达到50毫升，准备10毫升等量，并在-20℃下保存6个月
2 mM鱼藤酮原液：将4.7毫克鱼藤酮溶于6毫升无水乙醇中。搅拌均匀，直至完全溶解。CRITICAL 鱼藤酮在有机溶剂中暴露于光和空气中分解氧化。原先透明的溶液变成褐色。必须使用铝箔来保护原料溶液不受直接光线的照射。！ 谨慎鱼藤酮剧毒:避免皮肤接触和吸入。
600mM抗坏血酸原液：取5.2 g抗坏血酸溶于50 ml蒸馏水中，将pH值调节至7.4，并在-20℃储存6个月。
30 mM TMPD库存解决方案：取0.36g TMPD溶于50 ml蒸馏水中；调节酸碱度至7.4；在-20℃储存6个月。由于该化合物被氧气氧化，溶液呈深蓝色。
25 mg ml-1抗霉素A贮备溶液：溶解50毫克抗霉素A于2 ml无水乙醇稀释原溶液至25 ug ml-1，在2 ml无水乙醇中加入2 ul 25 mg ml-抗霉素A，就在使用之前。
！ 注意:抗霉素A具有高毒性，应避免皮肤接触和吸入。
细胞和小鼠肝脏线粒体分离(IBc)缓冲液：将10 ml 0.1 M Tris MOPS和1 ml EGTA/Tris加入到20 ml 1 M蔗糖中，制备100 ml IB。加入蒸馏水至100毫升。调整pH值至7.4。
肌线粒体分离缓冲液1 (IBm1)：将6.7 ml 1 M蔗糖、5 ml 1 M Tris/HCl、5 ml 1 M KCl、1 ml 1 M Tris/HCl混合，制备100 ml IBm1EDTA和2ml 10%牛血清白蛋白。调整pH值至7.4。加入蒸馏水至100毫升。
肌线粒体分离缓冲液2 (IBm2)：将25ml 1 M蔗糖、3ml 0.1 M EGTA/Tris和1ml 1 M Tris/混合，制备100ml IBm12盐酸。调整pH值至7.4。加入蒸馏水至100毫升。
细胞和小鼠肝脏线粒体(EBc)实验缓冲液：制备100ml EB c，混合1m KCl 12.5 ml, 1m Tris/MOPS 1 ml, 10ml 0.1 M EGTA/Tris和100ml Pi。调整pH值至7.4。加入蒸馏水至100毫升。
肌线粒体实验缓冲液(EBm)：制备100ml EB m，加入1ml的1m Tris/HCl, 1ml的0.5 m MgCl2, 200ml的1m Pi和20ml的0.1 m EGTA/Tris到25ml的1m蔗糖。调整pH值至7.4。加入蒸馏水至100毫升。用双蒸馏水清洗所有玻璃器皿三次，以避免Ca2+污染。Ca2+超载是孤立线粒体功能障碍的最常见原因。在实验当天准备所有的缓冲液，以避免细菌/酵母在储存的缓冲液中生长。由于pH值取决于温度，在25℃下测量所有溶液的pH值。
图3从MEFs中分离线粒体的时间。
PROCEDURE
1|线粒体可以从多种细胞或组织中分离出来。选项A描述了从小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)中分离线粒体(时间轴见图3);选项B描述从小鼠肝脏中分离线粒体(时间轴见图4);选项C描述了从小鼠骨骼肌中分离线粒体(时间轴见图5)
(A)从MEFs中分离线粒体的时间约为2小时
(I)从细胞中取出培养基，并用pbs洗涤细胞一次
(ii)取出PBS，并用细胞刮器分离细胞。
(iii)将细胞悬液转移至50 ml聚丙烯Falcon管中
(iv)用PBS清洗培养皿一次，然后刮去培养皿以分离剩余的细胞。
(V)将细胞转移到步骤3中定义的相同聚丙烯Falcon管中。根据我们的经验，播种120 x 106
实验前2天每皿MEFs导致良好产量的线粒体(约3毫克线粒体蛋白)
(vi)将细胞在600g、4℃条件下离心10 min
(vii)丢弃上清液，并将细胞重新悬浮在3 ml冰冷却的IB溶液中IBc
(viii)使用1 600转/分的Teflon研磨棒均质细胞;将置于玻璃制陶器中的细胞悬液按30 - 40times次于置于玻璃制陶器中的细胞悬液。
CRITICAL STEP Teflon–glass偶联代表了细胞均质化和线粒体完整性的保存之间的最佳妥协。更严酷的技术，包括玻璃制陶器中的玻璃杵，很容易破坏线粒体。
在开始操作前，将玻璃器皿在冰浴中预冷5分钟。均质和以下步骤必须在4℃下进行，以最大限度地减少具有破坏性的磷脂酶和蛋白酶的激活。
！ 注意在使用均质器时，请戴上防护手套，以避免在不太可能发生的情况下造成损坏。？
(ix)将匀浆转移到50毫升聚丙烯Falcon管中，在4 ℃下600克离心10分钟。
(x)收集上清，转移到玻璃离心管中，7000g, 4 ℃离心10分钟。？
(xi)弃掉上清液，用200µl冰冷的IBc清洗颗粒。将颗粒重新悬浮在200µl冰冷的IBc中，并将悬浮液转移到1.5毫升微滤管中。
(xii)7 000g匀浆在4 ℃下离心10分钟。
(xiii)倒出上清，重悬含线粒体的颗粒。你可以用玻璃棒来松开小球糊。避免加入IB，并尝试在丢弃上清后残留的少量缓冲液中重新悬浮线粒体。使用200µl 移液器，避免再悬浮过程中产生气泡。
(xiv)将线粒体悬浮液转移到微量离心管中，冷藏。
避免用缓冲液稀释线粒体。当线粒体以浓缩的形式储存时，它们的功能保持的时间更长，这可能是由于它们接触氧气的时间较低的结果。
(xv)用双缩脲法测定线粒体浓度。
PAUSE POINT线粒体现在可以在实验中使用了:在1-3小时内使用该制剂可以获得更好的功能反应。
CRITICAL STEP 这种制剂的典型收率为50 mg ml-1在大约0.1 ml的总体积中
CRITICAL STEP 在从本方案获得的蛋白质浓度范围内，用于测量线粒体浓度的缩二脲法是准确的；可以使用其他方法，如Bradford法，但必须稀释线粒体裂解物，以避免探针饱和。
图4 |小鼠肝脏线粒体分离时间。
图5 |小鼠骨骼肌线粒体分离时间。
(B)小鼠肝脏线粒体的分离时间约为1小时
(i)在分离实验前将小鼠饥饿过夜。
(ii)通过颈脱位杀死一只成年小鼠(约30 g)，并迅速从腹膜腔切除肝脏。找到胆囊，用手术刀取出。将肝脏浸泡在50毫升冰冷的IBc中，置于小烧杯中。关于动物护理和处理的地方和国家法规各不相同。检查你是否持有进行动物实验的适当授权。
(iii)使用冰冷的IBc清洗肝脏，除去血液。通常，四五次清洗就足以使IBc完全澄清。
(iv)用剪刀将肝切成小块。这应该在保持烧杯在冰浴中进行。
(v)丢弃切碎过程中使用的 IBc，代之以5毫升冰冷新鲜IBc。把悬浮液转移到玻璃制陶器上。均质和以下步骤必须在4℃条件下进行，以最大限度地减少破坏性磷脂酶和蛋白酶的激活。
(vi)用Teflon捣棒以1600转/分的速度将肝脏匀浆，轻击切碎的肝脏3至4次。组织与分离缓冲液的最佳配比为1:5 ~ 1:10 (w:v)。在开始操作前，将玻璃器皿在冰浴中预冷5分钟。均质和以下步骤必须在4℃下进行，以最大限度地减少破坏性磷脂酶和蛋白酶的激活。！ 注意在使用均质器时，请戴上防护手套，以避免在不太可能发生的情况下造成损坏。？
(vii)将匀浆转移到50ml聚丙烯Falcon管中，在4 ℃下600克离心10分钟。
(viii)将上清液转移到玻璃离心管中，在7000g的温度下在4 ℃下离心10分钟。？
(ix)弃掉上清液，用5ml冰冷的IBc清洗颗粒。
(x)在4℃下7000 g离心10分钟。
(xi)丢弃上清，重悬含线粒体的颗粒。你可以用玻璃棒来松开小球糊。避免加入IB，并尝试在丢弃上清后残留的少量缓冲液中重新悬浮线粒体。使用1ml移液器，避免在再悬浮过程中形成气泡。
(xii)将线粒体悬液转移到14 ml Falcon试管中，冷藏。避免用缓冲液稀释线粒体，因为在浓缩的情况下，线粒体保留功能的时间更长，最大限度地减少与氧气的接触。暂停点线粒体现在可以用于实验;在1-3小时内使用该制剂以获得更好的功能反应。
(xiii)用双缩脲法测定线粒体浓度。
线粒体关键步骤通常集中在这种准备是大约80毫克/毫升和总量大约是1 ml.
关键一步的双缩脲法测定线粒体蛋白质浓度范围的准确浓度从这个协议中获得;也可以使用其他方法，如Bradford法，但必须稀释线粒体裂解液，以避免探针饱和。
C)小鼠骨骼肌线粒体分离时间约1.5小时
(i)通过颈椎脱位杀死小鼠。使用手术刀，迅速取出感兴趣的骨骼肌，并将其浸泡在一个小烧杯中，该烧杯含有5毫升冰水PBS，其中添加了10 mM EDTA。图6列出了该协议的时间表。关于动物护理和处理的地方和国家法规各不相同。检查您是否持有进行动物实验的适当授权。用EDTA代替EGTA也能螯合Mg2+， Mg2+在肌肉组织中非常丰富(因为ATP含量很高)。Mg2+可影响线粒体功能及细胞色素c释放动力学25。
(ii)用剪刀将肌肉切成小块，并修剪可见的脂肪、韧带和结缔组织。
(iii)用含10 mM EDTA的冰水PBS清洗绞肉2 - 3次。(iv)将绞碎的肌肉用含10 mM EDTA和0.05%胰蛋白酶的5 ml冰水PBS重悬30分钟。
(v) 200g离心5分钟，弃上清。在IBm1中重新悬浮颗粒。
(vi)在IBm1中重新悬浮颗粒。
(vii) 使用每分钟1600转的Teflon捣棒均匀化肌肉;击打剁碎的肌肉十次。组织与分离缓冲液的最佳配比为1:5 ~ 1:10 (w:v)。在开始操作前，将玻璃器皿在冰浴中预冷5分钟。均质和以下步骤必须在4℃下进行，以最大限度地减少破坏性磷脂酶和蛋白酶的激活。！
注意在使用均质器时，请戴上防护手套，以避免在不太可能发生的情况下造成损坏。在开始以下步骤之前，将玻璃器皿在冰浴中预冷5分钟。？
(viii)将匀浆转移到50ml聚丙烯Falcon管中，在4 ℃下700g离心10分钟。
(ix)将上清转移到玻璃离心管中，在8000g、4 ℃下离心10分钟。？
(x)弃掉上清液，用5ml冰浴IBm2重新悬浮颗粒。
(xi)在4℃下8000 g离心10分钟。
(xii)弃上清，重悬含线粒体颗粒。你可以用玻璃棒来松开小球糊。避免加入IB，并尝试在丢弃上清后残留的少量缓冲液中重新悬浮线粒体。使用200ml移液器，避免在再悬浮过程中产生气泡。
(xiii)将线粒体悬液转移到14 ml Falcon试管中，冷冻保存。(xiv)用双缩脲法测定线粒体浓度。该制剂通常产0.8 ml 50 mg/ml -1线粒体。双缩脲法测量线粒体浓度是准确的范围内的蛋白浓度从本协议获得;也可以使用其他方法，如Bradford法，但必须稀释线粒体裂解液，以避免探针饱和。
测量线粒体呼吸时间约1 h
2|校准克拉克型氧电极。程序因仪器而异。你应该按照制造商的说明使用你所使用的仪器。
3|将装有缓冲液的烧杯置于连接oxygraph的水浴中，平衡EBc或EBm的温度和氧张力。在20 - 30分钟后，缓冲液的温度很可能与水浴的温度达到平衡。
4|向血氧仪室中加入适量的EB。从细胞中分离出的线粒体用0.5 ml，肝脏和肌肉线粒体用1或2 ml。关闭血氧仪室。
5|开始记录耗氧量。
确认记录是稳定的，没有明显的漂移。漂移可能掩盖了线粒体制备的耗氧量，从而使结果的解释复杂化。？
6|等待2分钟，获得稳定基线。
7|使用适当的汉密尔顿微注射器，加入线粒体，最终浓度为1mg/ml 1。由于分离出的线粒体缺氧，会观察到舱内氧含量的短暂快速下降;随后是线粒体的呼吸作用引起的缓慢的减少。这是由内源性底物支持的，通常称为状态1呼吸26。
8|记录耗氧量直到停止。！ 在肝脏线粒体状态1时，呼吸通常不会停止。
9| 使用汉密尔顿微型注射器，添加适当浓度的呼吸底物和抑制剂复合物的呼吸链你想研究(参见表1)。线粒体悬液现在将开始消耗氧气的呼吸链的基底活动抵消内部的线粒体膜质子泄漏。这就是所谓的 ''state 2’’呼吸状态。现在耗氧速率应该比单独使用缓冲液观察到的速率快。这表明你已经获得了有功能的、可呼吸的线粒体。
10|记录5分钟。
11|加入ADP，最终浓度为100 - 150µM。会观察到更快的氧气消耗。这是由于质子通过ATP酶的茎部分反向扩散造成的，而ATP酶通过呼吸链更快地流向末端电子受体O2，得到了补偿。这就是通常所说的“状态3”呼吸。
现在，耗氧速率应该比单独使用底物时观察到的速率快，这表明我们已经获得了良好耦合的线粒体。用ADP观察到的呼吸增加因组织和底物的不同而不同。作为一般规则,以及质量控制的唯一目的的准备,最低要求来进行这次实验如下:使用谷氨酸酸盐作为底物,保持2的比例从细胞系中分离的线粒体和4的比率线粒体从组织中分离出来的线粒体。
12|等待呼吸减慢，恢复到加入ADP前的速率。这是由添加ADP的消耗引起的。ADP衰竭后的呼吸通常被称为“状态4”呼吸26。
13|等待3分钟。
14| 加入解耦剂FCCP，最终浓度为60-100 nM。
15|呼吸会加速，达到略高于记录状态3呼吸时的值。？ 故障排除
16|再记录5分钟，然后停止记录。
步骤1A:大约2小时，取决于使用的细胞数量;然而，细胞需要提前2 - 3天播种才能生长
步骤1B:大约1小时;然而，老鼠需要从前一天晚上开始禁食
步骤1C: 1.5小时，这取决于切碎的肌肉量
预期结果
线粒体制剂的目标是获得大量相对纯净、偶联良好的线粒体。获得的细胞器的质量可以用氧合照相法测定其耗氧量来检验。例如，从小鼠肝脏中分离出来的线粒体，在谷氨酸/苹果酸的刺激下，通过添加6倍的ADP对atp酶产生反应耗氧量的增加(图6b)。这通常反映了高度纯净和完整的线粒体。仔细看看常规电镜形态学和其他细胞内的细胞器分离膜的纯度显示大部分细胞器的显示一个完整的内部和外膜,由其他膜污染水平保持在最低(图6)。
图6 |根据所提供的方案分离的小鼠肝线粒体的超微结构和耗氧量。(a)线粒体超微结构。通过加入戊二醛(最终浓度2.5% (v/v))固定在补充有5 mM谷氨酸盐和2.5 mM苹果酸盐的EB中孵育5分钟的小鼠肝线粒体(0.5 mg ml/1)。透射电子显微照片是从随机选择的视野中获得的，如18所述。(b)补充5 mM谷氨酸盐和2.5 mM苹果酸盐的1 ml EB的耗氧量。如所示(箭头)，添加小鼠肝线粒体(MLM，最终浓度1 mg ml1)、ADP (100 mM)和FCCP (60 nM)。ADP刺激后的呼吸称为“状态3”，而消耗添加的ADP后的呼吸称为“状态4”。''