非小细胞肺癌分子和生物标志物分析原则，建议收藏
5.2021最新最全《NCCN》指南（附下载方法）
已确定多种基因改变可影响治疗选择。检测肺癌标本的这些改变，对于确定潜在有效的靶向治疗以及避免不太可能提供临床益处的治疗非常重要。
01.分子学检测主要因素
· 对分子结果的应用与解释至关重要的分子学检测主要因素包括：
使用适当认可的实验室，至少有CLIA认证
了解所使用的方法以及这些方法的主要局限性
了解通过特定分析检测（和未检测）的变化范围
在检测前，了解肿瘤标本是否进行过病理学检查和肿瘤富集（即显微解剖、肉眼分离）
检测实验室接受的样品类型
02.标本采集和管理
· 标本采集和管理：
虽然肿瘤检测已主要集中于使用 FFPE 组织，但越来越多的实验室接受其他类型的标本，特别是未通过 FFPE 法处理的细胞病理学标本。尽管 FDA 批准的多种伴随诊断检测不包括细胞块检测，但如果它是唯一的或最好的材料，强烈建议对这些标本进行检测。
使用微创技术获取标本用于 NSCLC 分子检测结果时，一个主要局限性是获得的组织标本可能不足以进行分子、生物标志物以及组织学检测。因此，为了能够进行所有合适的检测，支气管镜医生和介入放射科医生应获取足够的组织。
当组织极少时，实验室应采取技术以最大限度地获得用于分子和辅助检测的组织，包括专门的小活检组织学流程、包括用于诊断和预测性检测的“预”切片。
04.检测方法
下文分别逐一列举适当可行的检测方法的指征；但通常考虑使用几种方法：
◊ 用于临床实验室的二代测序 (NGS)。单独 NGS 分析并不能检出所有类型的改变，重要的是熟悉单独分析或联合分析可识别的改变类型。
◊ 如果可行，推荐此时通过广泛的基于专家组的方法进行检测，最常用 NGS。对于广泛检测无可识别的驱动癌基因的患者（尤其是从不吸烟的患者），考虑基于 RNA 的 NGS（如果尚未进行），以最大程度检测融合事件。
◊ 实时聚合酶链反应 (PCR) 可高度针对性地使用（针对特定突变）。采用该技术只能针对特定的改变进行检测评估。
◊ 桑格测序要求最大程度的肿瘤富集。未改良的桑格测序不适合检测富集后肿瘤标本中肿瘤仍不足 25％ 至 30％ 的突变检测，重要的是也不适于检测识别亚克隆事件（如耐药突变）。如果使用桑格测序，几乎总是推荐使用肿瘤富集方法。
◊ 可采用其他方法，包括上文未列出的复合方法（即 SNaPshot、MassARRAY）。
◊ 荧光原位杂交 (FISH) 分析用于拷贝数、扩增以及结构改变如基因重排等许多分析检查。
◊ IHC 专用于某些特定分析，可作为一个有用的替代或其他分析的筛选方法。
05.分子学分析靶点
下述突变/改变通常以非重叠的方式出现，但 NSCLC 中有 1％-3％ 的变异可能同时存在。
◊ EGFR 中最常见的突变（外显子 19 缺失，外显子 21 p.L858R 点突变）与对口服 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 的治疗反应有关；最新数据表明，对于无敏感 EGFR 突变的肿瘤，在任何线的治疗方案中均不应使用 EGFR TKI。
◊ 采用诊断性活检或手术后切除样本进行 EGFR 突变分子检测，以确认 EGFR 突变结果可用于 IIB-IIIA 或高风险 IB-IIA 期 NSCLC 患者的辅助治疗决定。
◊ 许多不太常见的 EGFR 改变累计约占 EGFR 突变阳性 NSCLC 的 10%（即外显子 19 插入、p.L861Q、p.G719X、p.S768I），也与对 EGFR TKI 治疗反应有关，但研究的患者人数较少。
◊ EGFR 外显子 20 (EGFRex20) 突变是一种异质突变组，其中一部分对靶向治疗有反应，需要详细了解特定的改变。
– EGFR p.T790M 是对第一代和第二代 EGFR TKI 有反应和成为其耐药机制的最常见突变。在使用第一代或第二代 TKI 期间出现进展且 p.T790M 为主要耐药机制的患者中，第三代 TKI 通常有效。若在既往未接受 EGFR TKI 治疗的情况下发现 p.T790M，需要进行遗传咨询，并可能需要进行生殖系基因检测。
– 大多数其他 EGFRex20 改变是一组不同的框内重复或插入突变。
▪ 这类突变通常对 EGFR TKI 治疗无反应，但特定情况除外：p.A763_Y764insFQEA 具有 TKI 治疗敏感性 p. A763_Y764insLQEA 可能具有 TKI 治疗敏感性
▪ 因此，EGFRex20 插入突变的特定序列非常重要，一些检测能在不检测序列的情况下识别 EGFRex20 插入突变的存在。在这种情况下，需要进行额外的检测，进一步明确 EGFRex20 插入序列。
◊ 随着 NGS 检测使用的增加，发现的其他 EGFR 突变越来越多；但不太可能确定个体改变的临床意义。
◊ 某些临床病理特征（例如吸烟状况、种族和组织学特征）与存在 EGFR 突变有关；但这些特征不应用于选择需接受检测的患者。
◊ 检测方法：实时 PCR、桑格测序（理想情况是肿瘤富集配对）和 NGS 是检查 EGFR 突变状态的最常用方法。
◊ 尽管已鉴定了多种融合伴侣，但 ALK 最常见的融合伴侣是棘皮类微管相关样蛋白 4 (EML4)。
◊ 存在 ALK 重排与对口服 ALK TKI 治疗反应相关。
◊ 某些临床病理特征（如吸烟状况和组织学特征）与存在 ALK 重排有关；但这些特征不应用于选择需接受检测的患者。
◊ 检测方法：FISH 分离探针方法是广泛使用的第一种方法。IHC 可作为一个有效的筛选策略。FDA 批准的 IHC（ALK [D5F3] CDx 分析）可作为独立检测使用，无需 FISH 确认。多种 NGS 方法可以检测 ALK 融合。某些情况下使用靶向实时 PCR 分析，尽管其不太可能检测与新型伴侣的融合。
◊ ROS1 有许多融合伴侣，常见的融合伴侣包括：CD74、SLC34A2、CCDC6 和 FIG。
◊ 存在 ROS1 重排与对口服 ROS1 TKI 治疗反应相关。
◊ 某些临床病理特征（如吸烟状况和组织学特征）与存在 ROS1 重排有关；但这些特征不应用于选择需接受检测的患者。
◊ 检测方法：可以采用 FISH 分选探针法；但它可能检测不出 FIG-ROS1 变异。可以采用 IHC 方法，但 IHC 对 ROS1 融合的特异性低，因此，ROS1 IHC 作为一个筛选程序，后续验证性检测是一个必要的组成部分。多种 NGS 方法可以检测 ROS1 融合，但基于 DNA 的 NGS 可能无法检出 ROS1 融合。某些情况下使用了靶向实时 PCR 分析，尽管其不太可能检测与新型伴侣的融合。
◊ BRAF 突变可见于 NSCLC。特定突变的出现导致氨基酸 600 部位改变 (p.V600E)，与对口服 BRAF 和 MEK 抑制剂联合治疗敏感相关。◊ 值得注意的是，在 NSCLC 中观察到 BRAF 的其他突变，目前尚不十分清楚这些突变对治疗选择的影响。
◊ 检测方法：实时 PCR、桑格测序（理想情况是肿瘤富集配对）和 NGS 是检查 BRAF 突变状态的最常用方法。虽然抗 BRAF p.V600 E 特异性单克隆抗体可商购，并且一些研究已经使用了这种方法，但仅在经过广泛验证后方可开展。
◊ 与肿瘤无 KRAS 突变的患者相比，存在 KRAS 突变预示生存差。
◊ KRAS 突变与对 EGFR TKI 治疗反应性降低有关。◊ 由于可靶向变异的重叠可能性较低，KRAS 中存在已知激活突变可能识别不太可能因进一步分子学检测受益的患者。
◊ 存在 METex14 跳跃突变与对口服 MET TKI 治疗反应相关。
◊ 一系列分子改变均可导致 METex14 跳跃突变。
◊ 检测方法：基于 NGS 的检测是检测 METex14 跳跃情况的主要方法，基于 RNA 的 NGS 在检测方面有所改善。IHC 无法用于检测 METex14 跳跃突变。
◊ 常见融合伴侣为 KIF5B、NCOA4 和 CCDC6；但还确定了其他许多融合伴侣。◊ 存在 RET 重排与对口服 RET TKI 治疗反应相关，无论融合伴侣如何。
◊ 检测方法：可以采用 FISH 分选探针法；但它可能检测不出某些融合。某些情况下使用了靶向实时逆转录酶 PCR 分析，尽管其不太可能检测与新型伴侣的融合。基于 NGS 的方法特异性高，对于融合检测，基于 RNA 的 NGS 优于基于 DNA 的 NGS。
◊ NTRK1/2/3 为酪氨酸受体激酶，是 NSCLC 和其他肿瘤类型中罕见的重排，导致信号传导失调和不当。
◊ 已经确定了多种融合伴侣。
◊ 迄今为止，除了缺乏其他驱动改变外，尚未发现与这些融合相关的具体临床病理特征。
◊ NTRK1/2/3 的点突变通常为非激活，尚未就其与靶向治疗关系进行研究。
◊ 检测方法：可以使用多种方法检测 NTRK1/2/3 基因融合，包括：FISH、IHC、PCR 和 NGS；可能出现假阴性。某些组织中存在基线表达使 IHC 方法复杂化。FISH 检测可能需要至少 3 组探针才能进行全面分析。NGS 检测可以检出广泛变化。基于 DNA 的 NGS 可能不能检出 NTRK1 和 NTRK3 融合。
· 在无法在治疗开始前合力完成所有生物标志物完整评估的情况下，若有病灶可进行采样和检测，可考虑在一线治疗期间进展时重复广泛检测或选定生物标志物检测。
06.靶向治疗期间进展的检测
对于许多上面列出的分析物，人们越来越认识到治疗耐药的分子机制。对接受靶向治疗期间发生活动性进展的肿瘤样本进行重新检测，有助于阐明下一步的合适治疗：
◊ 对于已经接受 EGFR TKI 治疗、具有潜在 EGFR 敏感突变患者，合适的检测最低限度应包括高敏感性 p.T790M 评估；无 p.T790M 证据时，检测其他可能耐药机制（MET 扩增、ERBB2 扩增）可用于指导患者接受其他治疗。存在 p.T790M 的患者可接受三代 EGFR TKI 治疗。– 检测 EGFR p.T790M 的方法应设计为分析灵敏度至少有 5% 的等位基因分数。初始敏感突变可作为多种测定方法的内部对照，以确定是否存在检测范围内的 p.T790M 亚克隆事件。
◊ 对于已经接受 ALK TKI 治疗、具有潜在 ALK 重排的患者，尚不清楚识别特定酪氨酸激酶结构域突变是否可以确定治疗合理的下一步治疗，尽管一些初步数据表明特定激酶结构域突变可影响下一线治疗。
07.PD-L1（程序性死亡配体 1）
· PD-L1（程序性死亡配体 1）：PD-L1 是一种共调节分子，可在肿瘤细胞上表达并抑制 T 细胞介导的细胞死亡。T 细胞表达 PD-1（一种负调控因子），与包括 PD-L1 (CD274) 或 PD-L2 (CD273) 的配体结合。在 PD-L1 存在情况下，T 细胞活性受抑。
检查点抑制剂抗体可阻断 PD-1 和 PD-L1 的相互作用，从而改善内源性 T 细胞的抗肿瘤作用。
可使用 IHC 检测 PD-L1 以确定一线抗 PD-1/PD-L1 最可能有效的疾病。
◊ 已经开发出用于 IHC 检测 PD-L1 表达的各种抗体克隆，虽然一些呈现相对等价，一些则否。
◊ 对 NSCLC 中 PD-L1 IHC 的解释通常集中于表达任何水平膜染色的肿瘤细胞比例，因此为线性变量；其他肿瘤类型的评分系统可能有所不同。
◊ 基于肿瘤比例评分 (TPS)，FDA 批准的 PD-L1 辅助诊断方法可指导帕博利珠单抗用于 NSCLC 患者。TPS 是显示部分或全部膜染色的存活肿瘤细胞的百分比（任何强度）。
◊ 阳性和阴性检测的界定取决于使用的特定抗体和平台，其对每个检查点抑制剂治疗可能是唯一的。PD-L1 的多种不同检测方法的潜力引起了病理学家和肿瘤学家的关注。
◊ 尽管存在致癌驱动因素的患者 PD-L1 表达可能升高，但是针对致癌驱动因素的靶向治疗应优先于免疫检查点抑制剂治疗。
08.血浆游离细胞/循环肿瘤 DNA 检测
不应使用游离细胞/循环肿瘤 DNA 检测代替组织学诊断。
一些实验室提供外周循环中核酸的分子学改变检测，最常见的是经过处理的血浆（有时称为“液体活检”）。
研究表明，游离细胞肿瘤 DNA 检测通常特异性非常高，但敏感性大幅降低，假阴性率高达 30％。
游离细胞肿瘤 DNA 分析的性能特征尚无公认标准，而且，与基于组织的检测相比，没有关于此类检测推荐性能特征的指南。
游离细胞肿瘤 DNA 检测可以识别与关注病变无关的改变，如意义未明的克隆性造血 (CHIP)。
在特定的临床环境中可以考虑使用游离细胞/循环肿瘤 DNA 检测，最值得注意的是：
◊ 如果患者身体状况不适合进行侵入性组织采样
◊ 在初始诊断时，如果在病理学确认 NSCLC 诊断后无足够材料进行分子分析，则仅在计划对所有未发现致癌驱动基因的患者进行后续基于组织分析的情况下,才使用游离细胞/循环肿瘤 DNA 进行分析。