分析细致的免疫相关预后标志物3分+SCI模板
An immune relevant signature for predicting prognoses and immunotherapeutic responses in patients with muscle-invasive bladder cancer (MIBC)免疫相关特征可预测肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）患者的预后和免疫治疗反应
一、 研究背景
免疫细胞抗肿瘤活性的激活对于免疫疗法的有效性是必要的，肿瘤微环境TME包括许多类型的免疫细胞，它们与肿瘤细胞具有复杂的生物学关系，并可能导致肿瘤发展或抑制，TME中免疫细胞的多样性可能是导致免疫治疗反应差异的原因之一，对MIBC患者的TME进行充分评估，找到预测免疫治疗反应的生物标志物，将有助于制定适当的治疗方案。
二、 分析流程
三、 结果解读
1.MIBC患者TME的免疫浸润情况
作者对四个MIBC队列（TCGA-BLCA（膀胱尿路上皮癌），IMvigor210、GSE13507、GSE32894）使用ssGSEA分析，根据表达谱数据推断24种免疫细胞的相对丰度。根据免疫细胞的浸润密度，进行无监督聚类，将MIBC患者分为不同的浸润组。为了提高结果的稳定性，对于大样本队列（TCGA-BLCA [n = 384]和IMvigor210 [n = 195]），作者将患者分为三个免疫浸润组：高/中/低浸润，而小样本队列（GSE13507 [n = 62]和GSE32894 [n = 93]）分为两个免疫浸润组：高/低浸润。图1.A是三个免疫浸润组的免疫细胞热图，可以看到MIBC患者的免疫浸润模式之间存在明显的异质性。比较高浸润组和低浸润组之间的PD-L1 mRNA表达水平（图1.B）发现高浸润组中PD‐L1表达显著高于低浸润组，但是误差比较大，作者将在其他样本中进一步验证。在图1.C中作者发现免疫浸润性高的患者比浸润性低的患者生存时间更好。最后，使用R包meta的固定效应模型Fixed effect model汇总了四个队列的HR，结果证实了高浸润性TME患者的OS时间要比低浸润性的更长（HR = 0.61，I2=0，P = 0.97），I2是异质性检验的结果，为0说明无异质性。
图1.TCGA-BLCA和IMvigor210队列中MIBC患者中TME的免疫浸润情况
2.不同免疫浸润亚型的基因组和转录组特征
由于高浸润组和低浸润组的OS之间存在显著差异，作者推测在不同浸润组之间基因组，转录组和生物学途径也可能存在差异。作者计算了TCGA-BLCA队列中MIBC患者的50条生物途径的富集得分，发现具有低浸润TME的患者具有更高的肿瘤增殖相关途径富集得分（如靶向MYC，G2M检查点， DNA修复和MTORC1信号转导），高浸润的患者具有更高的免疫相关途径富集得分（如炎症反应，同种异体移植排斥，上皮间质转化和补体）（补充图3.A）。接着作者比较了不同浸润组的转录组数据，使用R包limma和Venn图鉴定出总共6种免疫相关的lncRNA（补充图3.B）和11种免疫相关的miRNA（补充图3.C）。
图2.A的热图显示了免疫相关的6种lncRNA和11种miRNA在不同免疫浸润组的分布。作者还使用相关性分析来验证了图2.A的结果，在6个lncRNA中，AC092580.4，USP30-AS1，CTA-384D8.35和AC002331.1的表达水平与大多数免疫细胞的丰度呈正相关，而其余lncRNA与大多数免疫细胞的丰度呈负相关。对11种miRNA也同样进行了相关性分析，结果均符合图2.A的结果。然后作者比较不同浸润组之间MIBC基因组的突变和拷贝数变异（CNV）。图.B中显示了作者使用R包ComplexHeatmap 绘制的前25个常见突变基因的oncoprint。接着，作者使用Genomic Identification of Significant Targets in Cancer （GISTIC）2.0算法鉴定了基因组的扩增或缺失区域，发现高浸润性TME患者的CNV频率要比低浸润性TME患者的CNV频率低（Kruskal-Wallis检验，P <.001），且已知较高频率的CNV总是预测肿瘤患者的预后较差。
补充图3.不同浸润组之间基因组，转录组和生物学途径差异
图2.不同免疫浸润亚型的基因组和转录组特征
3.DEG的聚类和功能分析
通过比较高浸润组和低浸润组之间mRNA的表达水平，作者确定了与免疫浸润相关的DEG。在TCGA-BLCA，IMvigor210和两个GEO队列中共发现了1802、935、525和371个与免疫浸润相关的DEG。使用GO数据库对DEG进行了途径富集分析，并以热图和树状图的形式显示了四个队列的相似GO term。结果显示了多种与免疫有关的途径（如髓样白细胞分化，白细胞粘附的调节，T细胞活化的调节，淋巴细胞增殖的正调节，B细胞活化，免疫效应过程的正调节和白细胞介导免疫的调节）在这四个队列中有类似的富集。然后图3.B根据三个浸润组的DEG重叠情况鉴定了282个DEG。接下来，作者通过282个DEG的无监督分层聚类，将患者分为三个基因亚组（G1，G2和G3），比较了G1，G2和G3组的生存时间，OS在三组之间有显著差异。然后，作者还使用了Kruskal–Wallis检验比较三种基因亚型之间免疫细胞的差异，对于大多数免疫细胞，G1组和G3组的免疫细胞相对数量显著高于G2组。
图3. DEG的聚类和功能分析
4.TIM signature的建立
为了探讨DEG与MIBC患者预后之间的关系，作者使用survival包对282个DEG进行了单变量Cox回归分析，共发现20个DEG与MIBC患者的OS高度相关（P <.01）。接着，使用LASSO Cox回归从20个预后DEG中选择了9个关键预后基因（图4.A），使用各自的回归系数构建了由这9个主要预后基因组成的TIM signature。九个基因之间的关系如图4.B，CCDC80，CD3D，CIITA，FN1，GBP4，GNLY，UBD和VIM彼此呈正相关，而SPINK1与其他八个基因呈负相关。根据TIM得分将患者分组进行生存分析后，发现TIM风险高的患者的预后较TIM风险评分差（图4.C）。图4.D显示了用于预测1~10年OS的TIM signature的AUC，结果表明TIM预测预后具有良好的敏感性和特异性（AUC均> 0.5）。图4.E显示了IV期MIBC患者比II期和III期患者具有更高的TIM风险评分。作者继续比较了五种分子亚型的TIM得分，发现腔乳头亚型的TIM得分最低，而神经元亚型的TIM得分最高（图4.F）。
为了进一步验证TIM在MIBC患者的预后预测中的稳定性，作者使用meta包汇总了四个队列的HR，结果验证了高TIM风险评分与较差的预后相关，低TIM风险评分与预后更好相关（HR = 2.11，95％CI = 1.29-3.43）（图4.G）。然后作者汇总了7169名泛癌患者的15种实体瘤的HR，以进一步评估TIM的表现。尽管不同肿瘤的HR之间存在较大的异质性（ I2 = 87％，P <.01），但结果也证实TIM风险评分可以预测癌症患者的预后（HR = 1.43，95％CI = 1.12-1.82）（图4.H）。
图4. TIM signature的建立
5.TIM信号与TME的免疫浸润有关
9个主要预后DEG与24个免疫细胞之间的相关性如图5.A所示，UBD，GBP4，CD3D和CCDC80的表达水平与多种免疫细胞的丰度高度相关。然后，作者计算PD-L1 mRNA与九种主要预后DEG之间的相关性，发现GBP4（r = .64），GNLY（r = .69）和UBD（r = .63）与PD-L1高度相关。然后，作者分析了TIM风险评分与免疫细胞之间的关系，发现TIM风险评分与适应性免疫细胞（细胞毒性细胞，T细胞，aDCs，Th17细胞等）的丰度呈负相关，而与先天免疫细胞（NK细胞，巨噬细胞，肥大细胞等）的丰度呈正相关（图5.B）。绘制了Sankey图以显示TIM评分与肿瘤亚型之间的关系，结果表明TIM评分低的患者主要与高免疫浸润基因亚型（G3）和更好的生存状态有关（图5.C）。
然后作者进行了GSEA分析，验证TIM评分高或评分低的患者的基因是否富含先前定义的生物学途径。作者发现，具有较高TIM得分的患者的基因在与肿瘤相关的途径富集，包括血管生成，顶端连接，上皮-间质转化，有丝分裂纺锤体和肌生成（图5.D），TIM评分低的患者的基因在免疫相关途径富集，包括干扰素α反应和干扰素γ反应（图5.E）。总的来说，TIM可能具有推断MIBC患者TME特征的潜在价值。
图5.TIM与TME的免疫浸润有关
6.TIM信号可以预测MIBC患者的免疫治疗反应
由于TIM评分与MIBC患者的预后以及免疫浸润的密度密切相关，为探讨TIM是否可以预测ICI的免疫治疗反应，作者采用了两种计算方法来推断TCGA-BLCA患者的免疫治疗反应。首先，使用“Tumor Immune Dysfunction and Exclusion （TIDE）”的Web程序（http://tide.dfci.harvard.edu），根据基因组的转录组图谱推断每个样品的抗PD1和抗CTLA4免疫治疗反应，发现TIM得分低的患者比高风险得分的患者具有更高的反应率（卡方检验，P <.001）（图6.A）。然后，用子类映射subclass mapping（https://cloud.genepattern.org/gp）来计算TCGA-BLCA队列的转录组谱与47例先前有详细免疫治疗信息的黑素瘤患者的转录组谱之间的相似性来推断免疫治疗反应，发现TIM分数低的患者更有可能对PD-1抑制剂免疫疗法有反应（Bonferroni校正的P = 0.008）（图6.C）。TIM分数的预测能力也在IMvigor210队列中得到证实，该队列具有详细的免疫疗法信息，发现对免疫疗法有反应的患者的TIM评分较低（图6.D,G，稳定疾病（SD）/进行性疾病（PD），完全反应（CR）/部分反应（PR））。TIM得分低的患者比高风险得分的患者有更高的缓解率（图6.E,H）。
最后，ROC曲线显示TIM是预测MIBC患者免疫治疗反应的理想模型（图6.B-TCGA：AUC = 0.69，95％CI = 0.63-0.74; 图6.F-IMvigor210：AUC = 0.64，95％= 0.55-0.74）。
图6.TIM可以预测MIBC患者的免疫治疗反应
小结
本篇文章根据MIBC患者的转录组数据估算了24种免疫细胞的相对数量，无监督的层次聚类分析表明MIBC患者之间的免疫浸润确实存在异质性。生存分析表明，高TME浸润患者和TME低浸润患者的预后显著不同。为了简化TME与预后之间的关系，构建了由9个与预后相关的DEG组成的TIM评分，TIM得分低的患者的免疫治疗反应率显著高于TIM得分高的患者，最后ROC分析证实TIM标记具有预测MIBC患者免疫治疗反应的理想能力。
研究的论证思路严谨，先从免疫微环境开始进行聚类分析，再到基因组、转录组数据差异分析，构建TIM评分，进行了两次分组，多次的生存分析，生物途径分析和相关性分析，把免疫浸润特征，基因特征与预后紧密联系在一起。最后一节用两种计算方法来推断免疫治疗反应也值得读者学习，但研究仍存在一些局限性，未评估其他预后指标，如临床病理特征。