Nature子刊：EV用于包装CRISPR-Cas9蛋白和sgRNA以诱导治疗性外显子跳跃

来自病毒载体的CRISPR-Cas9核酸酶和gRNA的长时表达可能导致脱靶和免疫原性。因此，治疗的基因组编辑应用需要瞬时递送系统。来自日本京都大学的Akitsu Hotta研究组通过利用两种不同的归巢机制，开发了一种基于细胞外纳米囊泡的核糖核蛋白递送系统，名为NanoMEDIC。

化学诱导的二聚化将Cas9蛋白募集到细胞外的纳米囊泡中，然后产生病毒RNA包装信号和两个自切割核糖开关链，并将sgRNA释放到纳米囊泡中。该研究展示了在各种难以转染的细胞类型中的有效基因组编辑，包括人类诱导多能干细胞（iPS）、神经元和成肌细胞。NanoMEDIC还可以在源自Duchenne肌营养不良（DMD）患者iPS细胞的骨骼肌细胞中实现超过90％的外显子跳跃效率。最后，单次肌内注射NanoMEDIC会在萤光素酶报告基因小鼠和mdx小鼠中诱导永久性的基因组外显子跳跃，表明其可用于DMD及其它疾病的体内基因组编辑治疗。

成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白（Cas9）能够有效编辑培养中的人类细胞，并具有作为治疗人类疾病的治疗工具的潜力。然而，需要CRISPR-Cas9的体内递送来靶向感兴趣的组织。Duchenne肌营养不良症（DMD）是一种严重的肌肉变性疾病，由X连锁基因抗肌萎缩蛋白（dystrophin）突变引起。骨骼肌和心肌细胞中缺乏抗肌萎缩蛋白，会导致肌肉稳定性下降并导致肌肉消瘦。据报道，CRISPR-Cas9是诱导iPSCs和体内动物DMD模型恢复抗肌萎缩蛋白表达的外显子跳跃的有效工具。

腺相关病毒（AAV）已经成为体内基因传递的主要工具，并通过传递CRISPR-Cas9系统用于治疗DMD动物模型。然而，关于其在治疗中的潜在用途，存在一些局限性和担忧，包括有限的病毒基因组DNA包装能力（<5kb），抗AAV衣壳的中和抗体以及对Cas9蛋白的免疫原性。此外，可以观察到AAV转基因的长时间表达。对于SpCas9表达，这不是理想的，因为它可能会导致不需要的脱靶诱变。确实，最近的报告表明，用递送SaCas9的AAV载体处理的小鼠显示出免疫原性，并且将AAV载体DNA片段整合到宿主基因组中。为了使这些不利影响最小化，需要一种瞬时递送方法。

CRISPR-Cas9的核糖核蛋白（RNP）递送优于DNA递送。它与DNA质粒表达载体相比，在培养细胞中RNP迅速降解，因此有助于有效的靶上剪切，同时还减少了不必要的脱靶效应。但是，将CRISPR RNP复合物递送到难以转导的组织中需要合适的递送系统，该系统需要有效地包装、保护感兴趣的货物并将其运送到目标组织中。

病毒是蛋白质和核酸的天然载体，可传递到细胞中。通过表达病毒包膜和/或结构蛋白而产生的，缺乏病毒核酸基因组的细胞外囊泡（EV）可以用于蛋白质和RNA传递载体，并已在疫苗接种领域用于临床试验。逆转录病毒的结构多蛋白Gag是经过充分研究的，是将货物包装到EV中的理想选择，并且可以诱导EV从细胞中主动释放，据估计，每个病毒颗粒最多包含5000个Gag分子。以前，该研究团队和其他人已经将HIV和MLV Gag与感兴趣的蛋白质融合在一起，以传递到细胞中。

尽管已有研究报道了EV介导的CRISPR-Cas9 RNP递送方法，例如将SpCas9与逆转录病毒Gag融合的Cas9P LV和NanoBlades系统、被动掺入SpCas9的VEsiCas系统或使用基于二聚化掺入SpCas9的Gesicle系统，但其在体内肌肉组织的适用性尚未阐明。此外，SpCas9与Gag的直接融合需要补充野生型Gag-Pol，以通过蛋白酶介导的裂解从Gag中释放Cas9，不然这会在EV中竞争空间并减少包装的SpCas9分子的数量。Pol中包含蛋白酶也有在靶蛋白隐蔽位点蛋白酶介导降解的风险，从而会减少递送的功能蛋白的数量。因此，需要Cas9蛋白和sgRNA的主动掺入机制，其不涉及Cas9蛋白与Gag的直接融合。

总之，该研究开发了一种称为NanoMEDIC（nanomembrane-derived extracellular vesicles for the delivery of macromolecular cargo）的多合一EV递送系统。NanoMEDIC可有效诱导各种人类细胞类型的基因组编辑，例如T细胞、单核细胞、iPSC、iPSC衍生的皮质神经元和成肌细胞。NanoMEDIC也可以多路复用，以同时靶向DMD患者iPSC的剪接受体（SA）和供体位点（SD）以及转基因荧光素酶报道基因小鼠中。

a 与FKBP12和FRB-SpCas9融合的膜锚定结构的示意图。b 从细胞产生NanoMEDIC并传递到受体细胞中的示意图。

NanoMEDIC在DMD患者iPSC中诱导高效的基因组编辑

与质粒DNA转染相比，NanoMEDIC介导的基因编辑无毒并降低脱靶活性

NanoMEDIC的瞬时肌肉内递送可在小鼠模型中诱导持续的基因组外显子跳跃

参考文献：Gee, P., Lung, M.S.Y., Okuzaki, Y. et al. Extracellular nanovesicles for packaging of CRISPR-Cas9 protein and sgRNA to induce therapeutic exon skipping. Nature Communications 11, 1334 (2020). DOI: 10.1038/s41467-020-14957-y

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