生物分析专栏 | 痕量检测技术助力生物分析

生物分析是药物研发过程中的重要一环，包括药代动力学（PK）和生物标志物分析等，贯穿了药物研发从早期筛选到临床研究再到上市后监测的整个过程。药代动力学通常是临床研究的一个重要终点，非临床和临床药代动力学不仅指导临床试验的剂量选择，其中药物的吸收、分布、代谢和排泄等数据也是药物研发过程重要考虑因素。

生物标志物是客观评价生理状态，判断疾病发生、发展和预后的指标物，可反映生物机体在环境相互作用中发生的可被测定的特征性改变[1]。生物标志物作为一种辅助手段，在药物研发的不同阶段有多种可预期的应用。然而生物分析目前仍面临诸多挑战：

  • 在低剂量给药时，有效的药代动力学研究可能需要具有超高灵敏度的检测平台对生物样本中药物浓度进行定量。

  • 体内许多蛋白质由于表达量低，特别是一些被证明具有临床意义的蛋白质生物标记物没有被充分利用。

  • 部分生物样本（如脑脊液）采集困难，而血液或其它基质中的相关生物标志物的浓度远低于脑脊液，甚至低于传统技术的检测下限，因此很难使用常规检测方法来检测。

  • 对于生物药，除了如高分析灵敏度要求，还需要增加通量、减少样本量要求和减小基质干扰[2]。

因此，必须使用高质量、高灵敏度的痕量检测技术获取可靠的数据，推进药物的研发进程。

检测平台

配体结合测定法（Ligand binding assays ，LBAs）是蛋白质分析物检测中常用的一种方法，而酶联免疫吸附测定法（ELISAs）已成为多种生物基质中使用配体结合测定法检测蛋白质分析物的首选方法，其操作优势和缺陷也广为人知。

近年来，LBA检测平台的发展更加多样化，这在很大程度上归功于新技术的进步，从电化学发光平台到新一代平台，包括Gyrolab™[3] ，Erenna® (Singulex) [4]，Simoa (Quanterix) [5]和Immuno-PCR [6]。

与传统免疫分析平台相比，新技术具有明显的技术优势，有潜力解决药物研发过程中面临的生物分析挑战，实现了更大的动态范围。基于bead方法的引入，加上单分子检测的标准化和放大检测信号的能力，已经提高了许多免疫检测的灵敏度，在某些情况下甚至提高了几个数量级。

图1 不同免疫分析平台格式区别[7]
灵敏度是生物分析方法中的最关键的部分，代表该方法检测与药效、作用模式和安全性相关浓度范围内分析物的能力[2]。然而大多数超灵敏技术平台提高灵敏度的方法都着重于检测信号的放大。如Immuno-PCR依托于免疫PCR平台放大检测信号，从而检测单个DNA分子。虽然Immuno-PCR具有显著高于ELISA和其他技术的灵敏度，但仍存在高背景干扰，并且这种干扰会在操作步骤中进一步放大[8]。而其他技术平台，包括MSD、DELFIA和AlphaLISA为基于酶反应的信号放大，通过荧光、电化学发光和其他模式进行检测。分析灵敏度很大程度上依赖于对其目标物具有高亲和力、选择性和特异性试剂的使用。通过优化分析条件，如缓冲液、试剂浓度和孵育条件等逐步提高灵敏度。但这会受到酶的催化效率、载体分子的结合能力、非选择性放大结合与非结合物的限制[9]。因此信号的放大可能并不会将灵敏度提高至某些待测物所需的水平，很少有能够达到亚皮克或每毫升飞克水平的超灵敏检测。而利用单分子计数则可以来实现超敏性，在每毫升毫微克的水平上进行蛋白质定量[10]。目前使用单分子计数的检测平台有Quanterix的Simoa™、Singulex的SMC™和Chimera的Imperacer®。
表1 三种平台技术性能与检测灵敏度的比较[2]
三种平台各有千秋，每个平台应用于生物分析时都展现其独特的优势。然而在选择某种技术平台时不仅要彻底了解新兴单分子检测技术的优缺点，还要彻底了解与应用相关的成本和风险。平台的选择应该由项目需求和生成数据的预期用途来驱动。本文主要以Simoa为主，介绍这种痕量检测技术在生物分析中的应用。
Simoa技术介绍
Simoa（Single-molecule array）是当今最灵敏的免疫检测技术之一，通过在Simoa微孔阵列光盘的二十多万个飞升大小的孔中，捕获和密封磁珠上的单个免疫复合物，采用数字算法，实现飞摩尔的灵敏度水平。

图2 Simoa检测原理[2]

Simoa技术灵敏度比ELISA提高出1000倍以上，达到fg/mL级，是超低丰度生物标志物、微剂量PK检测的真正王者。除了在灵敏度上的改进外， Simoa平台还是一个完全自动化的系统。仪器为全自动化平台，可以进行样品稀释（高达1:10稀释）、混合、洗涤、培养和数据采集步骤。Simoa还可以通过为个体捕获抗体使用不同的染料连接剂，同时测量多达10种不同的分析物 [11]。
通过fg/ml级的灵敏度，使Simoa在药物研发、体外诊断、伴随诊断、生命科学等方面，有着广阔的应用。本文主要从大分子PK研究、不同领域的生物标志物分析等方面介绍Simoa这种痕量分析技术在生物分析中的应用。
Simoa应用于大分子PK研究
在药物研发过程中，尤其是早期研究，包括微剂量研究、I期临床的剂量递增研究等，完整的药代动力学行为曲线对于定量描述药物在体内的动态变化规律、建立PK/PD模型具有重要意义。然而低剂量下PK血药浓度的检测往往受限于检测平台的灵敏度。另外对于免疫激动剂、双特异性抗体等治疗剂量在μg/kg水平的抗体类药物，常规ELISA、MSD等免疫分析技术很难获得完整的药代动力学行为曲线。Simoa的开放式免疫分析体系（Homebrew），可以大大提高灵敏度，几乎可以完成任何剂量水平的PK检测。
图3 Simoa、MSD、Gyrolab、ELISA平台动态范围的比较[7]
Simoa应用于生物标志物研究

生物标志物在药物研发中有着广泛的应用。可监测早期药物研发进程中的生物学效应，确定临床前和临床研究中的给药剂量和给药方案。因此须采用一种适合的方法来进行蛋白质生物标志物的评估。FDA指南草案列出了在生物标志物在分析验证过程中需要评估的基本指标[12,13]，这是FDA首次在生物分析方法的背景下正式讨论生物标志物适用的方法。生物标志物评价通常涉及多种分析物，因此使用较少的样本量和/或具备高通量检测能力的平台有较大吸引力。Simoa是一个全自动化的高通量检测平台，并能同时对多个分析物进行快速、灵敏的检测，以减少分析物之间的交叉反应。使用Simoa能够更加清楚地检测疾病相关的超低丰度生物标志物，提供更早期疾病诊断、更好预后和更加靶向的药物治疗手段。

1. Simoa应用于肿瘤治疗领域

血液或体液中生物标志物评价不仅可用于肿瘤的早期诊断和辅助诊断，同时对判定疗效、判断预后、预测肿瘤复发和转移以及靶点发现都具有重要价值。
胰腺癌因患者存活率低和生存期极短，是恶性程度最高的肿瘤之一。胰腺癌早期缺乏特异性的症状，通常被确诊时已经进入中晚期，且大部分已发生转移扩散。胰腺肿瘤微环境的星状细胞（pancreatic stellate cell，PSC）的激活始于胰腺癌发生的早期，故而可以为临床检测提供灵敏且丰富的蛋白因子。有研究发现介导胰腺癌细胞和星状细胞之间信号转导的关键因子白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor, LIF），通过阻断LIF和其表达基因的敲除均能显著减缓肿瘤的进展，增强化疗的疗效，延长胰腺导管腺癌小鼠模型的生存期。通过建立小鼠模型和人体Simoa分析，系统地验证了其作为胰腺癌治疗靶点和生物标志物的可行性，发现胰腺癌患者中外周血LIF水平显著升高，循环LIF水平的变化与疗效密切相关。

图4 健康受试者与PDAC患者血液及组织中循环LIF水平[14]

宫颈癌是全球第四大女性恶性肿瘤。宫颈鳞状细胞癌(SCC)是最常见的组织学亚型，约占所有病例的70%。鳞状细胞癌抗原(SCC-Ag)是公认最有用的生物标记物。多项研究表明宫颈鳞状细胞癌患者治疗前血清SCC-Ag滴度升高与不良肿瘤特征和不良预后（肿瘤大小、肿瘤分级、间质浸润、血管浸润及淋巴结转移等）显著相关。Shuang Ye等[15]人使用Simoa平台建立了新的敏感的SCC-Ag免疫分析模型，首次对根治性手术后的SCC-Ag进行了描述。术前和术后的SCC-Ag值可以很好地预测肿瘤的侵袭性。

图5 使用Simoa检测SCC-Ag在各时间点的中位值和范围[15]

2. Simoa应用于神经疾病领域
在神经退行性变领域，脑脊液（CSF）里中枢神经系统（CNS）生物标记物的研究已经取得了很大进展。通过腰椎穿刺取脑脊液的方式被认为是一种安全的、耐受性好的手术，但它的使用可能受到某些禁忌症(如服用抗凝血药)、病人不依从性或缺乏资源的限制。这种昂贵、费时的侵入式样本收集方式限制了脑脊液生物标志物的使用。更容易获得的生物基质，如血液或尿液，无疑将改善获取样本困难的现状，并通过采集多个时间点的样本，跟踪疾病进展。然而，由于血脑屏障的选择性以及高的血液/脑脊液体积比，血液中CNS生物标志物的浓度远低于脑脊液，甚至低于传统技术的检测限度，因此很难使用常规检测方法来检测[16]。同时血液中生物标志物浓度与CSF浓度的相关性也是研究中关注的重点。
神经丝蛋白轻链（NfL）作为CNS生物标志物，是神经元的主要结构蛋白。当神经轴突损伤后，CSF中的NfL释放增加，随后以低水平释放到外周血中。血液中NfL水平可以预测和监测各种中枢神经系统炎症和神经退行性疾病的进展，并评估未来神经保护治疗策略的有效性和/或毒性。Simoa与ELISA、电化学发光法（ECL）相比，在测定CSF和血清中NfL中显示出超高灵敏度，且血清中NfL水平表现出与CSF良好的相关性。
表2 用ELISA、ECL和Simoa检测CSF和血清中NfL[16]
随着超灵敏免疫检测技术的可用性增加，血液生物标志物评价将大大降低神经退行性疾病筛查的成本，并通过减少侵入性样本采集而提高患者的依从性。
3. Simoa应用于眼部疾病
脉络膜新生血管性眼病，如糖尿病性黄斑水肿(DME)、糖尿病性视网膜病变或湿性老年性黄斑变性(wAMD)，是由视网膜血管异常渗漏和新生血管增生引起的，是世界范围内视力损害的主要原因。通过玻璃体内注射抗VEGF-A药物，与VEGF-A结合位点相应受体相结合，可通过消除信号传输，抑制视网膜新生血管增生，减轻视网膜组织的水肿和渗出。近年来，抗VEGF-A药物的治疗已显著改善新生血管年龄相关性黄斑变性(nvAMD)或DME患者的预后，并已成为标准治疗方法。因此房水和玻璃体液的VEGF-A成为眼部疾病诊断最值得关注的生物标志物之一。免疫测定法如ELISA或Luminex基于bead的免疫测定法已成功应用于分析这些眼部体液中的VEGF-A。
由于房水和玻璃体液体积有限且采样困难，对此类稀有样本，Simoa可通过灵敏度优势通过对稀有样本进行稀释检测VEGF-A水平。如罗氏进行双抗药物Faricimab临床试验时，同时使用Luminex平台和Simoa平台进行测定DME患者房水中VEGF-A水平。Simoa平台即使在样品量低至12μL的情况下（须稀释处理），也可以检测出给药后的VEGF-A水平和趋势。

图6 糖尿病黄斑水肿患者玻璃体内注射抗VEGF-A药物Faricimab治疗后房水样本VEGF-A浓度分析[17]

4. Simoa应用于细胞因子检测
细胞因子是免疫细胞分泌的一种小蛋白，促进细胞间相互作用和交流。细胞因子是免疫系统的主要监管机构, 通过控制各种过程包括蛋白表达、基因调控和细胞增殖，调节固有免疫和获得性免疫反应。由于细胞因子与疾病的发生发展密切相关，细胞因子作为许多疾病的生物标志物引起越来越多的关注。然而，许多细胞因子在健康状态下存在于极低甚至难以检测的水平，这使得生理细胞因子基线的充分表征和应用成为一项挑战。
一些细胞因子在体液中可达到皮摩尔（pM）或更高水平，而大多数细胞因子在飞摩尔（fM）或更低水平表达。如白介素-6（IL-6）已被发现是各种疾病的重要生物标志物，但IL-6只能在其水平较高的急性期检测到。由于细胞因子水平与疾病的类型和分期有关，因此在健康或无症状/疾病前阶段的受试者中，使用超敏感的方法分析细胞因子能够为健康监测或早期疾病诊断提供大量信息。研究个体细胞因子水平随时间的自然波动，检测微小的干扰变化，将有助于深入了解生理基线，并使疾病的早期诊断成为可能，同时也将促进个性化医疗的发展。
利用Simoa技术可以直接对正常人群细胞因子进行检测，如IL-1α、IL-1β、IL-2、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-17A、TNF-α和IFN-γ等低丰度炎症因子，并已被应用于疾病早期阶段的诊断，如登革热病毒感染、蓖麻毒素中毒、克罗恩病等。

图7 10例患者89份血清细胞因子检测结果（左图）；8例健康受试者基线细胞因子水平的变化（右图）。条形图的长度表示总方差(总平方和)，白色和黑色分别表示受试者间和受试者内变异的总方差的百分比。误差条表示方差的均方误差值。

还有文献[19]报道可以利用Simoa检测呼气冷凝液（exhaled breath condensate ，EBC）中的细胞因子。从医学和公共卫生的角度来看，EBC是一个有吸引力的选择，因为样本采集是非侵入性的，可以在婴儿和呼吸机患者身上进行。然而，EBC也是稀释度最高、最难分析的人体生物基质，仅含有较少的代谢物和蛋白质。与使用血浆相比，EBC检测对高通量免疫分析提出更困难的挑战。利用Simoa的高灵敏度及全自动化，将EBC稀释后可以检测不同的细胞因子。

图8 Simoa检测分别使用去离子水（实验1）和buffer（实验2）稀释的EBC中IL-6水平[19]
结语
定量PK、生物标志物评价等生物分析是药物研发的重要组成部分，其结果在很大程度上取决于分析的质量和平台。痕量分析技术的发展无疑加快了药物研发进程。Simoa作为一种痕量分析平台在大分子PK研究和不同领域的生物标志物研究中都显示出无可比拟的优势。
随着蛋白质工程技术的发展，工程蛋白治疗的种类越来越多，在可预见的未来还将继续增加。这些高度功能化、可定制的分子具有传统蛋白治疗模式无法提供的潜在优势。越来越多的新方法和替代支架将对生物分析方法发展提出新的挑战[20]。痕量生物分析技术的发展必将会推动全球药物研发的进程，为全人类的健康做出巨大贡献。

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阳光德美生物分析专栏

北京阳光德美医药科技有限公司是一家集大/小分子药物临床前/临床PK/PD服务于一体的综合性研究平台，可提供全方位的药代动力学-药效学和GLP生物分析服务，专注于解决客户药代药效研究及生物分析中所遇到的挑战。
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