【单细胞文献解读】转移性肺腺癌的异质性及动态变化
远端转移是肺癌致死的主要原因。理解转移性肺癌的肿瘤微环境动态变化，可以揭示肿瘤诱导的免疫改变，有助于探索新的免疫治疗策略。
患者及样本：44个初治的肺腺癌患者，收集其早期的原发灶、正常组织、正常淋巴结。晚期的转移病灶、转移淋巴结、脑转移灶，以及胸水。
测序平台：10x Genomics
原发灶中T细胞和髓系细胞最多。
与正常组织相比，T细胞、B细胞在早期病灶中富集，NK细胞、髓系细胞在晚期病灶减少。
与正常淋巴结相比，转移的淋巴结中髓系细胞较多，说明转移的过程伴随着更多的髓系细胞浸润。
脑转移样本中包含免疫细胞(T细胞,B细胞,NK细胞)，少突胶质细胞和髓细胞（小胶质细胞），其中少突胶质细胞仅在脑转移灶中出现。
小结：在特定的组织中存在着定居的细胞群。随着肿瘤的生长和侵袭，这些细胞群的组成也在动态变化着。
正常组织的上皮细胞可细分为4个亚群：AT1，AT2，club cells(棒状细胞)， ciliated cells(纤毛细胞)。
肿瘤组织的上皮细胞包括：非恶性的上皮细胞以及恶性上皮细胞。
通过细胞轨迹分析，发现了上皮细胞的三种分化状态：S1,S2,S3。其中S3以正常组织的纤毛细胞为主。S1和S3失调的基因参与了上皮表面活性物质的稳态、肺泡发育以及纤毛运动，说明S1和S3状态代表了正常分化程序的失调。而S2以肿瘤组织中的恶性细胞为主，S2特异性表达的基因与侵袭性细胞运动和异常增殖或凋亡有关。
通过TCGA外部数据集研究，发现S2-high组的LUAD患者具有较短的OS，说明S2 signature参与LUAD的进展和转移。
内皮细胞可细分为8个亚簇，进一步分析发现：
大多数内皮细胞亚簇都来源于正常组织，包括：尖细胞(tip cell)和柄样细胞(stalk cell)，淋巴细胞和内皮祖细胞。
其中一个内皮细胞亚簇只在肿瘤组织和脑转移灶中出现，表现出较强的VEGF和notch信号通路活性。
在肿瘤组织和脑转移灶中，有很多血管生成基因表达上调，说明原发肿瘤和脑转移灶诱导着类似的血管改变来适应新的微环境。这些数据进一步支持了针对肺癌和脑转移的促血管生成途径的治疗策略。
在肿瘤组织和脑转移灶中，有很多免疫活性相关基因表达下调，说明了肿瘤的内皮细胞可以抑制免疫应答。
成纤维细胞进一步细分为12个亚群，其中7个可以映射到已知细胞类型中，包括：COL13A1+间质纤维细胞，COL14A1+间质纤维细胞，肌成纤维细胞，平滑肌细胞，间皮细胞(mesothelial cells)，以及来源于脑组织的纤维细胞，周皮细胞。
COL13A1+,COL14A1+间质纤维细胞在正常肺、早期肺中比例最高。
肌成纤维细胞只来源于肿瘤组织（包括原发灶和转移灶），已有研究报道，肌成纤维细胞可以促进组织重塑、血管生成以及肿瘤进展。
小结：在原发灶和转移灶中，发现基质细胞和内皮细胞的表型 向促进组织重构和血管生成的表型转化。
在正常肺组织中观察到的巨噬细胞亚群有：抗炎的肺泡巨噬细胞(APOE+,CD163+, C1QB+)，促炎的肺泡巨噬细胞(IL1B+, CXCL8+)，以及表达抗炎Makers的循环肺泡巨噬细胞。
在肺部肿瘤组织以及远端转移病灶中，富集了很多抗炎的单核-巨噬细胞（M-C0），以及促炎的单核-巨噬细胞 (M-C2）。
在正常组织和肺癌组织中，都发现了S100A9+单核细胞(M-C3)和树突状细胞(DCs)。
一些巨噬细胞亚群与组织来源特异性相关，包括：来源于胸水的巨噬细胞亚群(M-C8,9)，这些细胞不表达促炎相关的细胞因子(IL1B-,CXCL8-)，但表达CD163(该基因与非炎症的表型相关)。来源于转移的脑组织中的小胶质细胞和巨噬细胞(M-C11)。
通过细胞轨迹分析，发现促炎的单核细胞沿着时间轴向巨噬细胞转化，细胞逐渐失去了促炎特性，获得了抗炎特性。这一转变最终达到了一个分支点，即两个巨噬细胞亚群要么保留了部分促炎特征，要么偏向抗炎表型特征。
正常肺组织中，促炎的巨噬细胞居多；肿瘤原发灶以及转移灶中，富集更多的抗炎巨噬细胞。在转移灶中，发现一个特异性的巨噬细胞亚群(高表达巨噬细胞炎症因子MIF, CXCL3, CCL20)。
小结：在LUAD原发灶和转移灶中，肿瘤相关的巨噬细胞(TAMs)主要从单核细胞(Mo-Ma)中而来，而这些巨噬细胞与正常组织中原本驻留的巨噬细胞不同。
CD1c+ DCs (Langerhans cells, LCs)
CD141+ DCs
CD207+CD1a+ LCs
pDCs (plasmacytoid DCs，浆细胞样树突状细胞)
CD163+CD14+ DCs
activated DCs
分析不同树突状细胞亚群在不同部位的肺组织中分布，发现：
浆细胞样树突状细胞(pDC)在正常肺组织中几乎不存在，而只在肿瘤组织或转移淋巴结中出现。
pDCs代表着免疫抑制的表型，表现为LILR家族基因的上调，GZMB的产生，以及CD86、CD83、CD80和LAMP3的不表达，呈现了一个免疫抑制的微环境。
小结：Mo-Macs和pDCs都创造了一个免疫抑制的微环境，可能影响了原发灶及转移灶中的抗原呈递。
滤泡B细胞(follicular B cells)
胞浆B细胞（表达IgG）
粘膜相关的淋巴组织来源B细胞（MALT B）表达immunoglobulinsA, J CHAIN
颗粒酶分泌的B细胞(granzyme B-secreting B cells) (GZMB+)
生发中心B细胞(germinal center) in the light zone (LMO2, BCL2A1)
生发中心B细胞(germinal center) in the dark zone (STMN1, AICDA, MKI67, BIRC5)
正常肺组织富含颗粒酶分泌的B细胞毒性细胞，其分化受T细胞来源的IL-12调控。
原发肿瘤和转移的淋巴结中，有更多的生发中心B细胞。
小结：在一些肺腺癌患者中，体液免疫反应被高度激活。各B细胞亚型表现出略有不同的B细胞受体或Ig轻链，提示产生了肿瘤抗原特异性B细胞，以及克隆扩增。
CD8+ T (naive, 效应，衰竭)
naive CD4+ T
耗竭型滤泡辅助性T细胞(exhausted T follicular helper)
辅助型T细胞
调节性T
NK细胞
进一步分析，发现：
在原发肿瘤组织中，NK细胞缺失，Treg细胞富集。
Treg细胞存在于肿瘤组织或淋巴结，转移脑组织，在肿瘤进展和转移过程中提供抗肿瘤免疫抑制的微环境。
从细胞轨迹来看，CD8+ T细胞表现出动态的功能状态图谱，包括naive、细胞毒性以及耗竭状态。
耗竭型CD8+ T细胞主要来源于肿瘤组织(包括原发灶和转移灶)，而细胞毒性效应细胞CD8+ T细胞主要来源于正常肺组织。
Naïve的CD8+T细胞主要来源于正常组织和胸水。
通过对不同组织来源的40个细胞亚群进行卡方检验，进一步确定了在肺腺癌进展过程中的细胞动态，发现：
mo-Macs, pDCs, Tregs, myofibroblasts 以及肿瘤内皮细胞 在原发肿瘤和远端转移中广泛分布。
alveolar mac, pleural mac, microglia/mac, and FB-like Cells，只在特定的组织部位中出现。
耗竭型的CD8+T细胞和mo-Macs在肺腺癌进展期和转移期比例增加。而且肿瘤微环境中，这两个亚群的比例与TMB的高低相关。
在肺部肿瘤组织中，恶性上皮细胞S2与mo-Macs及基质细胞之间有很强的crosstalk，其中S2与mo-Macs最相关，mo-Macs与耗竭型CD8+T细胞最相关。而mo-Macs和耗竭型CD8+ T细胞的比例也与S2癌细胞的增加呈正相关。
mo-Macs可以为耗竭型CD8+T细胞提供激活(TNF-TNFRSF1B)和抑制性(LGALS9-HAVCR2)信号。
小结：肺腺癌中mo-Macs的功能复杂，会影响T细胞功能，间接平衡免疫活性和耗竭。