再显神威！PARP抑制剂在BRCA1/2野生型肿瘤中体现应用潜力 | Cell子刊
PARP抑制剂目前主要应用于存在BRCA1/2突变的DNA修复缺陷肿瘤中，通过诱导合成致死来抑制癌细胞生长。7月24日，Molecular Cell在线发表了来自德克萨斯大学西南医学中心的最新研究，揭示PARP抑制剂在BRCA1/2正常表达状态下，能够通过替代途径同样实现肿瘤的生长控制。这一研究为在BRCA1/2野生型肿瘤中拓展使用PARP抑制剂提供了理论依据。
近年来，有研究显示，PARP抑制剂在没有BRCA1/2突变或同源重组（HR）介导的DNA修复缺陷情况下，也可能表现出临床益处，表明PARP在DNA损伤修复中的作用可能不是其发挥治疗潜力的唯一原因。此外，科学家们对PARP1支持癌细胞生长的确切机制仍未知。
在该研究中，Dae-Seok Kim等将目光放在了小核仁RNA（snoRNA）上。snoRNA和基因调节蛋白（如DDX21和PARP1等）支持起始于核仁的核小体发生，snoRNAs是保守的小非编码RNA，可指导RNAs的加工和位点特异性转录后修饰，snoRNA介导的修饰促进rRNA在细胞核中的折叠和稳定性，从而在核糖体生物发生中发挥重要作用。DEAD-box RNA解旋酶DDX21也与核糖体生物发生有关，其与snoRNA相互作用以调节rRNA加工和修饰。PARP-1通过在核仁中的富集和与几种核仁蛋白的ADP-核糖基化（ADPRylation）与核糖体的生物发生产生关系；同时，PARP-1与非编码启动子相关的RNA（pRNA）结合，有助于建立沉默的rDNA染色质并抑制rRNA转录。然而，PARP-1结合的RNA种类和PARP-1-RNA相互作用的功能结果却是未知的；此外，（1）PARP-1-RNA相互作用在核仁中的作用，（2）PARP-1对蛋白质底物的位点特异性修饰在核糖体生物合成中的作用，以及（3）PARP-1依赖性核糖体生物发生在乳腺癌中的生物学功能及其作为靶标的潜力，均未得到确认。本文的研究人员试图为我们揭秘这些困惑，他们的研究证实：snoRNA激活PARP-1，而不是受损的DNA，控制rDNA转录、核糖体生物发生和蛋白质翻译，以促进乳腺癌细胞的生长。
1. 初识snoRNA/ PARP1/ DDX21相互作用
研究人员利用PARP-1定向RNA免疫沉淀（IP）结合自然条件下的深度测序（RIP-seq），确定了MCF-7乳腺癌中PARP-1结合的RNA类型。他们发现，虽然长非编码RNA（lncRNA）和mRNA是最丰富的可与PARP-1发生相互作用的RNA种类，但是snoRNAs却是最高度富集（下图B和C）和具备亲和力的，且MCF-7细胞中近一半的snoRNA（46％）与PARP-1结合。此外，研究还发现，与PARP-1相互作用或非作用的snoRNA，在丰度上也存在很大差异，并显示了不同的结合PARP-1的趋势。这些结果表明：PARP-1与snoRNA的结合不依赖于表达水平。
为了探索PARP-1-snoRNA相互作用的潜在生化功能，研究人员首先利用PARP-1结构域缺失突变体确定了与snoRNA相互作用的PARP-1区域（下图A和B），使用具有PARP-1结构域缺失突变体的RNA-EMSA测试了三种与PARP-1相互作用的snoRNA（SNORA73A、SNORA73B和SNORA74A）和一种非相互作用的snoRNA（SNORA15）。结果表明，PARP-1 DNA结合结构域对于结合snoRNA是必需且足够的，而催化结构域不能与snoRNA相互作用（下图C）。当然，非相互作用的snoRNA（SNORA15）没有与PARP-1产生相互作用。
在确认了结合位点后，科学家们想知道，PARP-1-snoRNA相互作用的生化功能具体是什么。体外研究发现，转录的PARP-1在可相互作用的snoRNA（37、73A、73B和74A）存在时，相对非相互作用的snoRNA（15、65）或空载体对照RNA（下图D），可实现强有力的自我修饰。通过snoRNA介导的活化，PARP-1完成预先自动修饰，降低了其与EMSA中的snoRNA结合的能力，通过用PARP抑制剂PJ34处理可恢复PARP-1-snoRNA相互作用（下图E和F）。这些发现表明，snoRNA-PARP-1相互作用激活PARP-1的催化活性和自身修饰，导致PARP-1对snoRNA的亲和力降低，允许其转运至其它靶蛋白对其进行修饰，包括DDX21。
接下来，研究人员首先利用化学生物和质谱法，鉴定出DDX21可做为PARP-1的位点特异性ADPRylation底物，随后使用生化分析，进一步确认了DDX21被PARP-1 ADPRylated。那么，DDX21和PARP-1是否在细胞中相互作用，以及又有哪些影响呢？首先，为去除所有snoRNA，研究人员对使用或未使用RNaseA处理的MCF-7细胞进行了IP测定确认，再通过PARP-1与DDX21的共免疫沉淀，显示DDX21与内源性PARP-1可相互作用：DDX21被ADPRylated（下图A、B）。用PARP抑制剂PJ34处理显著减少了DDX21的ADPRylation以及DDX21与PARP-1的相互作用。在使用RNase A消除snoRNA之后，消除了PARP-1与DDX21的co-IP（图A和B，顶部），以及PARP-1和DDX21的ADPRylation（图A和B，底部），结果与PJ34处理一致。这些数据表明，PARP-1催化活性是DDX21-PARP-1相互作用的先决条件。
2. snoRNA/ PARP1/ DDX21
从以上阐述的研究内容我们可以粗略地了解snoRNA、PARP-1和DDX21潜在的联系，那么在真实细胞功能中是否也是这样呢？该通路的最终潜在影响会有哪些呢？为了确认snoRNA、PARP-1和DDX21之间的潜在关系和影响，研究人员进行了体外PARylation测定，以确定snoRNA激活的PARP-1是否使DDX21 ADPRylation。在加入可与PARP-1相互作用的SNORA74A后，PARP-1实现自动修饰并观察到DDX21的ADPRylation（下图I和J）。重要的是，非相互作用的SNORA15不能刺激PARP-1的自动修饰或DDX21的ADPRylation（下图I和J）。同样，利用UV诱导的PARP-1自身修饰，增加了其与DDX21结合的能力。这些结果表明，无论以何种方式（包括生理性snoRNA或病理性UV诱导）促进刺激PARP-1的活性，聚（ADP-核糖）(PAR)都是DDX21-PARP-1相互作用的重要介质。
为了确定snoRNA在PARP-1和DDX21之间的功能性相互作用中的作用，在使用或不使用RNase A处理的MCF-7细胞中，将PARP-1与DDX21共免疫沉淀，证实了DDX21被ADPRylation以及与PARP-1之间的相互作用。用RNase A处理免疫沉淀物消除了PARP-1与DDX21的共免疫沉淀（下图A和B，顶部），以及PARP-1和DDX21 ADPRylation（下图A和B，底部），结果与PJ34处理一致。
此外，为了了解snoRNA如何在体内特异性调节DDX21-PARP-1相互作用和ADPRylation，研究人员使用反义寡核苷酸（ASO）以敲低与PARP-1相互作用的SNORA74A和非相互作用的SNORA15。正如预期，将SNORA74A或SNORA15的靶向ASO转染到MCF-7细胞中降低了DDX21-PARP-1的水平，但是靶向GFP的ASO没有起到同样的效果（下图C）。与SNORA15敲低相比，SNORA74A敲低导致PARP-1（下图D）和DDX21（下图E）以及DDX21-PARP-1相互作用（下图F）的ADPRylation显著降低。ADPRylation的显著减少表明，SNORA74A是PARP-1的主要激活剂。这些结果再次验证了之前的研究，表明RNase A处理破坏了PARP-1-DDX21相互作用及其在MCF-7细胞中的ADPRylation（下图A和B）。
在细胞增殖测定中，通过小干扰RNA（siRNA）耗尽PARP-1或通过短发夹RNA（shRNA）耗尽DDX21导致了MCF-7细胞增殖的显著降低（下图G、H），并且降低与PARP-1相互作用的SNORA74A也会导致增殖的显著降低（下图I）。然而，在原代人类乳腺上皮细胞（HMEC）中显示出不可检测的PAR水平，并且使用siRNA消耗DDX21不会导致细胞增殖显著减少。因此，这些结果表明：snoRNA刺激PARP-1和DDX21之间的功能性相互作用，包括刺激PARP-1催化活性导致DDX21ADPRylation，以促进乳腺癌细胞而非正常细胞的增殖。
3. 靶标潜力
在确认了snoRNA、PARP-1和DDX21之间的关系和生物功能之后，科学家们想知道，靶向该通路能否实现改变其生物功能的结果呢？此前，有文献也报道DDX21在核糖体生物合成中的作用主要是通过调节rDNA转录，但使用PJ34或尼拉帕利（一种PARP抑制剂）处理的MCF-7细胞的免疫荧光染色显示，DDX21能够从核仁重新分布到核质（下图A），而且还导致PARP-1的核仁定位显著减少（下图A），但不影响核仁标记物NOP58的定位（下图B）。这些结果表明，PARP-1的自动修饰和DDX21的ADPRylation对于其核仁保留是重要的。
先前已有研究表明，DDX21在rDNA基因座处结合Pol I转录复合物以调节rDNA转录。在MCF-7细胞中的染色质IP（ChIP）-qPCR测定中，研究人员再次证实，DDX21在rDNA基因座转录区内的多个区域高度富集，尤其是在8kb处（下图C）。用PJ34或尼拉帕利处理后该结合显著降低（下图D），表明在rDNA基因座处DDX21占据需要PARP-1对DDX21进行ADPRylation，用PJ34或尼拉帕利抑制PARP-1后该结合显著降低，在rDNA基因座处DDX21占据需要PARP-1对DDX21进行ADPRylation。
接下来，再次验证DDX21的ADPRylation对rDNA转录的影响。使用RNA BioAnalyzer检测到在用PJ34或尼拉帕利抑制PARP-1后，核18S和28S rRNA的水平显著降低，导致核糖体结合的核糖体蛋白显著减少（图G和H）。
核糖体生物发生和功能会对多种生物功能产生影响，如细胞增殖。在MCF-7细胞中，PJ34或尼拉帕利抑制PARP-1（下图K和L），或Dox诱导的shRNA对DDX21的消耗，导致细胞增殖显着减少。最后，经过对照和基因突变的研究，研究者们定位了该通路的完整生物学功能：snoRNA激活PARP-1 ADP-核糖基化DDX21以控制DDX21核仁定位、rDNA转录、核糖体生物发生和乳腺癌细胞增殖。
为了研究snoRNA-PARP-1-DDX21-核糖体生物发生途径的潜在生理和临床意义，经过基因图谱分析，与正常组织相比，DDX21在乳腺肿瘤样品中的表达显著更高（下图A-E）。此外，通过乳腺癌组织微阵列免疫组织化学染色也观察到这些蛋白质之间的显著正相关。因此，使用MCF-7细胞系进行异种移植，科学家们研究了PARP-1抑制对乳腺癌细胞生长的体内影响。工程化的MCF-7细胞系具有Dox诱导的内源性DDX21敲低以及FLAG标记的WT DDX21异位重新表达，用尼拉帕利抑制PARP-1催化活性导致肿瘤生长显著降低（下图F-H）。
对使用或不使用尼拉帕利处理的体内异种移植肿瘤组织的核提取物进行蛋白质印迹和IP测定显示，尼拉帕利显著阻断了PARP-1 ADPRylation（下图I）和随后的DDX21 ADPRylation（下图J）。同时，尼拉帕利不能促进BRCA1 / 2-WT MCF-7细胞中γH2AXfoci的积累，表明尼拉帕利的作用不依赖于DNA损伤。
最后，在使用或不使用尼拉帕利处理的情况下，从肿瘤组织中分离出总核RNA，并观察到在尼拉帕利处理后18S和28S rRNA的水平显著降低（下图L和M）。免疫染色显示，（1）尼拉帕利显著降低异种移植肿瘤中DDX21的核仁定位（DDX21的泛核染色增加）（下图N和O）和（2）在人乳腺癌组织中（下图P和Q）高水平的PARP-1表达与DDX21核仁保留密切相关。
最终，研究人员完成了snoRNA-PARP-1-DDX21通路的概念性验证，证实PARP-1催化活性在体内控制DDX21 ADPRylation、DDX21核仁定位、rDNA转录和乳腺癌细胞增殖；且使用尼拉帕利能够对这一通路产生积极影响。
4. 结论
总的来说，以上研究证明，在BRCA1/2-野生型乳腺癌细胞中，snoRNA激活PARP-1并引发PARP对DDX21的ADPRylate修饰，以促进核糖体生物发生和增强细胞增殖。snoRNA-PARP-1-DDX21核糖体生物发生轴提供了另外一种细胞途径，能够使PARP抑制剂在不考虑BRCA1/2突变状态的情况下，为患者提供潜在治疗益处。此外，DDX21（尤其是细胞核中的DDX21）或许可以作为一种新的生物标记物，用于指导PARP抑制剂的使用。
小结
相关论文：
[1] Dae-Seok Kim et al. Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21. Molecular Cell(2019).
新靶点
NKG2A | GARP | CD22 | 628个靶点 | LIF | CDK2 |
WWP1 | VCAM1 | CA19-9 | Flower | CD24 |
新疗法
双特异性抗体 | PROTACs技术 | 第四代EGFR抑制剂 | RNAi药物 | GCGR抗体 | AMPK激动剂 | 神奇胶囊| CAR-T疗法 | 降胆固醇新药 | 光照+声音 | 调节代谢 | 基因治疗 | 先天免疫 | 细胞治疗 | 智能i-胰岛素 | 胎盘干细胞 | 河豚毒素 | 感冒病毒 | 肠道细菌 | 肿瘤疫苗 | 溶瘤病毒
新机制
PD-1抗体与肠道菌群 | 细菌与癌症 | CCR5与中风康复 | 糖促进肿瘤 | 黄金钾 | PD-1加速肿瘤生长 | 癌细胞神秘偷渡PD-L1 | 乳腺癌耐药性 | 铁死亡 | PARP抑制剂 | 哮喘鼻炎之谜 | 致命心脏病 | TOX | 帕金森病 | 肺癌转移 | 高血压 | 减肥药 | 超级细菌毒力开关
流行病学
树叶
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