组织切片 HE 染色失败原因的查找和补救措施的研究

常规苏木素（Hematoxylin）和伊红（Eosin）染色技术简称 HE 染色技术。临床患者或动物实验的组织标本通过固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、摊片、贴片、烤片、染色和封片等一系列操作技术，制成一张组织切片，这是各种病理技术的基础。

HE 制片质量在很大程度上影响病理医师能否做出正确的病理诊断。优质的 HE 玻片标本：在显微镜下观察时应该达到核质清楚、红蓝分明、对比清晰。而制出大量优质的切片并非易事，在常规病理制片的过程中，经常会遇到各种原因引起的组织脱水、透明、浸蜡不足、组织切片染色灰白、组织结构不清等问题，导致染色失败，特别是胃镜活检标本、穿刺等小活检组织标本，由于组织小，一旦出现上述问题，大多都无法补取材。为避免再次发生此类事件，需及时查明失败原因，积极补救和调整。

在本研究中，我们通过多次试验，终于找出切片染色失败的主要原因，即脱水机处理组织不当。在此基础上，我们进行了染色失败标本补救措施的研究：

①对染色灰白的原切片退掉盖玻片以后重新处理。

②对组织处理不当的蜡块重新切片后处理切片后再复染。

③是将处理不当的蜡块组织经二甲苯多次脱蜡，入梯度乙醇直至水化，然后将发软的组织进行重新脱水处理。

研究结果表明：

补救措施③基本达到病理诊断的阅片要求，但存在较大风险，稍有不慎就会导致组织变脆变硬，制片困难；

而补救措施①和②则能够显著提高病理切片的质量，满足了病理诊断的要求。

研究方法

1.HE 染色失败原因的查找收集 HE 染色失败的 20 例病理标本，其中包括胃镜活检标本 5 例、肠镜活检标本 5 例、子宫内膜标本 5 例、肺穿刺标本 5 例。同时收集近日工作中染色正常的 20 例标本（胃镜活检标本蜡块 5 例、肠镜活检标本蜡块 5 例、子宫内膜标本蜡块 5 例、肺穿刺标本蜡块 5 例），以及当天免疫组织化学染色的 20 例 HE 切片进行对比观察。

试验设计分为 7 组：HE 染色失败的标本为染色失败组；染色失败的蜡块组织利用 4 种方法进行处理，为处理组1：切片后经调节后的染色机程序再染色(延长烤片时间)；处理组2：切片后经调节后的染色机程序再染色(更换新苏木素和伊红)；处理组3 ：切片后经调节后的染色机程序再染色(延长染色机中切片脱蜡和脱水时间)；处理组4：切片后经正常的染色机程序染色，再调节封片用的中性树胶浓度的玻片；同时，设立两个对照组，正常HE染色对照组：正常程序处理的石蜡标本切片经正常的染色机程序染色：免疫组化对照组：染色失败的石蜡标本经免疫组织化学染色程序后的 HE 切片。

2.染色失败标本补救措施的研究利用上述染色失败的 20 个标本，将 20 例标本利用 3 种方法分别进行处理。补救组1：将染色失败的 HE 切片放入二甲苯中浸泡 30 min，去掉覆在切片组织上的盖玻片，然后将切片移到 100%、95%、85%、70% 的乙醇中各 3 min，切片水洗 3 min。将水洗的切片放入盛 300 ml 蒸馏水的 500 ml 烧杯中进行水浴加热，将烧杯放入盛水的不锈钢锅中，用电炉或电磁炉加热，水沸腾后继续煮 30 min，将烧杯冷却至室温后取出切片，将切片重新染色。补救组2：将蜡块重新切片，将组织片贴片于防脱载玻片上，65℃ 烤片 30 min，常规脱蜡至水化，将切片放入盛自来水的不锈钢锅中水浴加热煮 30 min，再进行常规 HE 染色。补救组3：将蜡块组织经二甲苯多次脱蜡，入梯度乙醇直至水化，然后将发软的组织进行重新处理，即对蜡块组织逆程序处理到原组织水化状态，更新试剂后再次处理。同时，以染色失败的原始标本切片作为对照组。

研究结果

1.HE 染色失败原因的排查与染色失败组相比，处理组1、2和4的组织染色灰白，组织结构不清，无法满足诊断要求。与原始 HE 切片相比，其病理评分均无明显差异(p0.05)。处理组3的病理评分尽管与原始切片相比，在统计学上有显著性差异(p0.05)，但仍然不能满足临床病理诊断的要求。而正常 HE 染色对照组染色后镜下见核质清楚、红蓝分明、对比清晰，由此排除了烤片、染色机染色和封片等步骤的原因。此外，在免疫组化对照组中，染色失败玻片经免疫组织化学染色程序后HE切片染色效果基本等同于正常 HE 切片染色对照组。通过逐步排除，最终发现HE染色失败的原因是自动脱水过程中病理组织脱水处理不当引起的。

2.补救措施效果的评价根据病理切片染色后的评分情况，本研究发现 3 种补救方法处理的切片染色效果均较好，镜下见切片组织结构清晰，色彩鲜艳，红蓝对比适当，透明度好，完全达到了诊断标准。同时，与原始 HE 切片相比，其病理评分在统计学上均有明显差异(p0.05)。但由于补救措施③仅适用于组织块较大的标本，且存在一定风险，有可能造成组织块的损毁。而补救措施①和②在取得满意染色效果的同时，对组织标本不造成任何影响，因此我们推荐使用补救措施①和②来处理工作中出现的类似问题。

主要结论

影响石蜡切片 HE 染色的因素贯穿于整个组织处理及染色过程中，从组织离体后的固定、脱水处理及染色过程的每个步骤均会对 HE 染色产生影响。标本固定及染色过程导致的染色失败问题的解决，可通过逐一排查导致染色不良的因素，采取相应的解决办法及补救措施。

在本研究中，我们通过逐步筛查，发现了导致本次染色失败的根本原因是组织脱水机处理不当引起的。同时，我们利用 3 种不同措施对原切片和处理不当蜡块切片进行重新处理，发现了两种解决 HE 染色失败的补救措施，为今后临床病理工作者解决此类问题提供了科学依据。因此我们推荐使用补救措施①和②来处理工作中出现的类似问题。

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