Cre工具鼠的构建技术原理

简单来讲就是带有Cre重组酶的小鼠！为什么要使用Cre工具鼠呢？我们都知道当参与生长发育等重要基因缺失后会出现小鼠胚胎致死或出生后过早死亡，导致无法得到存活的子代，从而无法进行科学研究，所以这个时候就需要Cre工具鼠的存在了。通过cre-loxp重组系统实现在特异性的组织基因敲除，也可以通过加入诱导型的Cre来控制基因敲除的时间。还有一个原因就是物美价廉：一个flox 的小鼠就可以通过与不同Cre工具鼠的灵活搭配使用，来实现一鼠多用，既节约费用又节约时间。

Cre工具鼠既然这么神通广大，那我们如何能拥有它呢？其实Cre工具鼠的制作方式很简单，简单来讲就是把Cre重组酶整合到基因组就好了。研究人员一般会选用转基因或Knock in的方式来制作Cre工具小鼠（Cre工具鼠制作示意如图2），这样的小鼠中的Cre酶在表达的时候就受控于特异性基因启动子，当特异性基因启动子启动表达时，就可以实现Cre重组酶在特定组织或细胞表达。

图2.Cre工具鼠制作示意图

Cre重组酶的调控方式有多种多样，有如特异性基因启动子调控的Cre（Promoter-regulated Cre）、配体或药物诱导的Cre（Inducible Cre）、荧光报告的Cre（Fluorescent Cre）以及同时被不同启动子调控的Cre（Split Cre，NCre 和CCre）等。不同调控方式的选择造就了不同的Cre工具鼠。

接下来我们以特异性基因启动子调控的Cre和配体或药物诱导的Cre为大家详细介绍下到底是如何发挥作用的。一是全身性启动子调控的Cre，CAG-Cre、CMV-Cre等；二是组织特异性启动子调控的Cre，如肝脏特异性Alb-Cre、视网膜特异性Rho-Cre等等；三是诱导型的Cre（Inducible Cre），是受配体或配体衍生物调控的，如Cre-ER，由雌激素受体（estrogen receptor，简称ER）的配体结合区与 Cre 重组酶形成的融合蛋白，Cre-ER在胞浆中与HSP90结合，因结构过大无法进入细胞核；当雌激素衍生物Tamoxifen结合到Cre-ER受体结合的结构域后，Cre-ER会通过构象变化从锚定蛋白HSP90上解离下来，从而进入细胞核，识别Loxp位点并发生基因重组。这样就通过控制诱导时间，可以实现对基因重组时间特异性的调控（作用原理如图3所示）。

图3. Cre-ER作用原理^[4]

雌激素诱导型的Cre我们会遇到Cre-ER、Cre-ERT和Cre-ERT2 ，这三者的区别究竟是什么呢？其实Cre-ER是最原始的雌激素诱导的Cre，研究人员在实际工作中发现因动物本身就会分泌雌激素，会在还未加外源的雌激素诱导前Cre就会发生作用，所以无法完全实现Cre的时间特异性调控，这就是通常所说的Cre泄露（leaky）；为了避免内源性的雌激素的干扰，学者发现了一种突变体Cre-ERT：在ER的配体结合区做了一个点突变（G521R），可以实现使Cre-ER 只响应外源的人工合成雌激素，比如：Tamoxifen等 ，相比Cre-ER而言更加特异。随着研究的深入，研究人员发现另一种突变体就是 Cre-ERT2：具有远高于 Cre-ERT 的敏感性；因Cre-ERT2使用起来既简单又高效，所以也是最常使用的诱导型的Cre。

图4.四环素诱导Cre作用原理^[4]

还有一种诱导型的Cre是四环素诱导的Cre，分别是tet-on和tet-off两种系统，tetO-Cre发挥Cre重组酶作用时一般需要两种转基因小鼠交配使用：四环素响应启动子元件控制的 Cre 工具鼠和组织特异性启动子驱动的表达四环素转录活化因子 rtTA 或 tTA 的小鼠（作用原理如图4所示）。

目前Cre工具鼠资源丰富，基本上涵盖了研究者所有的用鼠需求，可以根据您感兴趣的组织选择对应的Cre工具鼠，当然也可以自行制作。如果需要全身敲除或敲入目标基因，可以选用全身性的启动子启动的Cre，如CAG-cre、CMV-cre等等，如果要特异性在某组织敲除或敲入目标基因，可以选用特异性启动子启动的Cre，如肝脏特异性Alb-Cre；视网膜特异性Rho-Cre等等；若需要Cre酶时空特异性表达，可以选用诱导型的Cre；如CAG-CreERT2、Alb-CreERT2等等；

表1. 部分Cre工具鼠种类及主要研究领域