大规模分离收获外泌体新技术，满足临床用量需求

外泌体（Exosomes）是活细胞分泌的，大小为30-200nm，密度为1.13-1.18g/mL的磷脂双分子层结构囊泡状小体，在电镜下呈现茶托状结构。

外泌体是由核内体系统形成的，主要经历3个阶段：首先，细胞质膜初次内陷形成内吞小体，多个内吞小体相互融合形成早期核内体；其次，早期核内体再次内陷包裹细胞内物质，形成多个腔内小囊泡，进一步转变成晚期核内体，即多泡体；最后，多泡体与细胞质膜融合，释放腔内小囊泡到细胞外空间，即外泌体[1]。Exo Carta数据库显示外泌体中含有41860种蛋白质、1116种脂质、3408种mRNA及2838种miRNA，通过与靶细胞融合释放其内的活性成分发挥作用，在细胞与细胞之间的信息交流中发挥着重要作用，同时也参与多种疾病的发生与发展。

▲图1：细胞外囊泡分泌原理（图片来源：网络）

目前，外泌体已逐渐用于包括心血管疾病、中枢神经系统疾病、癌症、肝损伤、肺损伤及肾损伤等疾病的诊断。另一方面，外泌体，尤其是干细胞外泌体，携带的大量生物活性物质，可代替干细胞发挥修复治疗多种重要器官及组织损伤的功能。而且外泌体的应用避免了细胞直接移植存在的多种潜在风险，且免疫原性低又便于保存和运输，作为“无细胞的细胞治疗技术”显示出独特的优势。

另外，由于外泌体的生物相容性与生物降解性，以及较低的毒性和较好的组织耐受性，外泌体也被认为是非常有应用前景的药物载体。

▲图2：外泌体的应用前景

外泌体不论是自身用于疾病治疗，还是做为药物载体递送平台，需求量均非常大，我们简要列出了外泌体临床前（表1）及临床研究（表2）中的剂量与给药策略[2]，可见大规模分离生产外泌体是外泌体临床转化的重要前提之一。

表1

使用基于外泌体的疗法临床前研究给药策略总结

Myocardial infarction (M.I); Intravenous (I.V); Intraperitoneal (I.P); Intracerebral ventricular (I.C.V); mouse bone marrow (mBM)

表2

使用外泌体作为治疗干预的临床试验总结

外泌体分离纯化方法的优劣势

然而，目前针对外泌体的分离纯化方法还没有统一的标准，严重制约着外泌体相关的基础研究及临床应用。

差速超速离心法是最常用的方法，被视为外泌体提取的“金标准”，但需要配备超速离心机，且操作复杂，耗时久，产量低，难以处理大批量样本；

密度梯度离心法也可实现外泌体的分离，但存在与差速超速离心法相似的问题；

免疫亲和法可分离表达特定蛋白质的外泌体，纯度较高，但该方法成本过高，也不适用于大量样本中外泌体的分离；

聚合物沉淀法可处理大体积的样本，但纯度较低，且聚合物材料的混杂可能会影响下游分析；

尺寸排阻色谱法简便、经济、回收率高，可处理中等体积样本，但不能分离与外泌体尺寸相近的颗粒，且经尺寸排阻色谱后的外泌体会被严重稀释，需要将其浓缩才能用于后续实验；

切向流超滤法成本低，实验重现性好，且富集效率高而不易形成聚集体，不影响外泌体的生物活性，更利于从大体积样本（如细胞培养上清、尿液）中分离外泌体，但纯度略低；

微流控法处理速度快、成本低，但只适合少量样本的提取。

上述分离方法在操作性、处理量、纯度及成本等方面各有优缺点，因此，急需开发一种强大且可扩展的方法用于大样本外泌体的分离。

3D FloTrix^® vivaEXO  

外泌体收获系统

此外泌体收获装置，是一款用于外泌体提纯的多级分离装置，可处理1-10L细胞上清，10L培养上清液处理完成仅需3小时左右。整体仪器按照现代医药卫生要求设计，设备主机和一次性耗材包符合卫生级制药要求，参数实时检测及控制准确，控制系统操作简单、合理。

▲图3：3D FloTrix^® vivaEXO  外泌体收获系统

产品特点：

1、处理量大，可从大体积样品（如细胞培养上清）中分离获得高浓度的外泌体；

2、耗时短，处理10L的细胞上清仅需3小时左右；

3、一体化集成，操作简单明了；

4、vivaEXO装置可与华龛生物vivaSPIN系列生物反应器连接，MSCs大规模培养后获得的细胞上清直接进入vivaEXO装置，一键分离外泌体；

5、所有分离柱均可定制，用于不同颗粒状物质（如微囊泡）分离。

客户案例

我们使用vivaEXO分离获得外泌体，并与超速离心法对比（客户案例）。

通过vivaEXO设备，1L细胞上清可获取外泌体颗粒数6.67×10¹²，平均粒径为102.5 nm；与之对比，通过超速离心法， 1L细胞上清可获取外泌体颗粒数8.9×10¹⁰，平均粒径为159.5nm。可见，采用vivaEXO获取的外泌体浓度较高，而且粒径更小。

图4  vivaEXO（左）与超速离心法（右）分离的外泌体粒径及

浓度示意图比较

另外，两种方法均可见外泌体的经典结构。

图5  vivaEXO（左）与超速离心法（右）分离的外泌体结构比较

外泌体western blot检测

图6  vivaEXO分离的外泌体CD63与TSG101蛋白表达

结论

使用vivaEXO外泌体分离装置获得的外泌体结构清楚，粒径较小，浓度较高。另外，本装置中所使用的分离柱均可以定制，用于其它物质的分离。

其它应用

1、 微囊泡分离；

2、 蛋白分离；

3、 病毒分离。

Ending

参考文献：

[1] Record M, Silvente-Poirot S, Poirot M, et al. Extracellular vesicles: lipids as key components of their biogenesis and functions [J]. J Lipid Res, 2018, 59(8):1316-1324.

[2] Gupta D, Maria Zickler A, El Andaloussi S. Dosing extracellular vesicles [J]. Adv Drug Deliv Rev, 2021, 178: 113961.