层析技术(色谱法,Chromatography)概念、分类和操作
层析技术概述
引言
层析法又称色层分析法或色谱法(Chromatography)，它是在 1903~1906年由俄国植物学家M. Tswett首先提出来的。他将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3管柱，并继续以石油醚淋洗，由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，色素被逐渐分离，在管柱中出现了不同颜色的谱带或称色谱图(Chromatogram)。
当时这种方法并没引起人们的足够注意，直到1931年将该方法应用到分离复杂的有机混合物，人们才发现了它的广泛用途。随着科学技术的发展以及生产实践的需要，层析技术也得到了迅速的发展。为此作出重要贡献的是英国生物学家Martin 和Synge，他们首先提出了色谱塔板理论。这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论，以理论塔板来表示分离效率，定量的描述、评价层析分离过程。其次，他们根据液－液逆流萃取的原理，发明了液－液分配色谱。特别是他们提出了远见卓识的预言：一、流动相可用气体代替液体，与液体相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有好处；二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高(即增加了理论塔板数)，这将会大大提高分离效率。前者预见了气相色谱的产生，并在1952年诞生了气相色谱仪，它给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变革；后者预见了高效液相色谱(HPLC)的产生，在60年代末也为人们所实现，现在HPLC 已成为生物化学与分子生物学、化学等领域不可缺少的分析分离工具之一。
因此，Martin 和Synge 于1952年被授予诺贝尔化学奖。如今的色层分析法经常用于分离无色的物质，已没有颜色这个特殊的含义，但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。现在我们简称为层析法或层析技术。层析法的最大特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。而且它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。因此，作为一种重要的分析分离手段与方法，它广泛地应用于科学研究与工业生产上。现在，它在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。
层析的基本理论
层析法是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。例如：我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数(或称分配常数)不同，达到彼此分离的目的。
对于一个层析柱来说，可作如下基本假设：
①层析柱的内径和柱内的填料是均匀的，而且层析柱由若干层组成。每层高度为H，称为一个理论塔板。塔板一部分为固定相占据，一部分为流动相占据，且各塔板的流动相体积相等，称为板体积，以Vm 表示。
②每个塔板内溶质分子在固定相与流动相之间瞬间达到平衡，且忽略分子纵向扩散。
③溶质在各塔板上的分配系数是一常数，与溶质在塔板的量无关。
④流动相通过层析柱可以看成是脉冲式的间歇过程 (即不连续过程)。从一个塔板到另一个塔板流动相体积为Vm。当流过层析柱的流动相的体积为V 时，则流动相在每个塔板上跳越的次数为n:n1=v:v1。
⑤溶质开始加在层析柱的第零塔板上。根据以上假定，将连续的层析过程分解成了间歇的动作，这与多次萃取过程相似，一个理论塔板相当于一个两相平衡的小单元。
层析的基本概念
(1)固定相
固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质(如吸附剂，凝胶，离子交换剂等)，也可以是液体物质(如固定在硅胶或纤维素上的溶液)，这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。
(2)流动相
在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。
(3)分配系数及迁移率(或比移值)
分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量(浓度)的比值，常用K 来表示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。
K = Cs / Cm
其中Cs: 固定相中的浓度，Cm: 流动相中的浓度。
迁移率(或比移值)是指：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用Rf 来表示。(Rf 大于或等于1)可以看出：K 增加，Rf 减少；反之，会减少，Rf 增加。
实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率是指：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。它可以小于等于1，也可以大于1。用Rx 来表示。不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。很显然，差异越大，分离效果越理想。
分配系数主要与下列因素有关：①被分离物质本身的性质；②固定相和流动相的性质；③层析柱的温度。对于温度的影响有下列关系式：
lnK = －(ΔG0/RT)
式中： K 为分配系数(或平衡常数)；
ΔG0为标准自由能变化；
R 为气体常数；
T 为绝对温度。
这是层析分离的热力学基础。一般情况下，层析时组分的ΔG0为负值，则温度与分配系数成反比关系。通常温度上升20℃，K 值下降一半，它将导致组分移动速率增加。这也是为什么在层析时最好采用恒温柱的原因。有时对于K 值相近的不同物质，可通过改变温度的方法，增大K 值之间的差异，达到分离的目的。
(4)分辨率(或分离度)
分辨率一般定义为：相邻两个峰的分开程度，用Rs 来表示，如图2—20。
图 2－20 计算分辨率示意图
VR1—:组分1从进样点到对应洗脱峰值之间洗脱液的总体积。
VR2— 组分2从进样点到对应洗脱峰值之间洗脱液的总体积。
W1—组分1的洗脱峰宽度。
W2—组分 2的洗脱峰宽度。
Y—组分1和组分2洗脱峰值处洗脱液的总体积之差值。
分辨率：
由上式可见，Rs 值越大，两种组分分离的越好。当Rs = 1时，两组分具有较好的分离，互相沾染约2%，即每种组分的纯度约为98%。当Rs=1.5时，两组分基本完全分开，每种组分的纯度可达到99.8%。如果两种组分的浓度相差较大时，这时 为了提高分辨率Rs 的值，可采用以下方法：
①使理论塔板数N 增大，则Rs 上升。
1)增加柱长，N 可增大，可提高分离度，但它造成分离的时间加长，洗脱液体积增大，并使洗脱峰加宽，因此不是一种特别好的办法。
2)减小理论塔板的高度。如减小固定相颗粒的尺寸，并加大流动相的压力。高效液相色谱(HPLC)就是这一理论的实际应用。一般液相层析的固定相颗粒为100mm；而HPLC 柱子的固定相颗粒为10mm
以下，且压力可达150kg/cm。它使Rs 大大提高，也使分离的效率大大提高了。
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3)采用适当的流速，也可使理论塔板的高度降低，增大理论塔板数。太高或太低的流速都是不可取的。对于一个层析柱，它有一个最佳的流速。特别是对于气相色谱，流速影响相当大。
②改变容量因子D(固定相与流动相中溶质量的分布比)。一般是加大D，但D 的数值通常不超过10，再大对提高Rs 不明显，反而使洗脱的时间延长，谱带加宽。一般D 限制在1 ￡ D ￡ 10，最佳范围在1.5~5之间。我们可以通过改变柱温(一般降低温度)，改变流动相的性质及组成(如改变pH 值，离子强度，盐浓度，有机溶剂比例等)，或改变固定相体积与流动相体积之比(如用细颗粒固定相，填充的紧密与均匀些)，提高D 值，使分离度增大。
③ 增大a(分离因子，也称选择性因子，是两组分容量因子D 之比)，使Rs 变大。实际上，使 a 增大，就是使两种组分的分配系数差值增大。同样，我们可以通过改变固定相的性质、组成，改变流动相的性质、组成，或者改变层析的温度，使 a 发生改变。应当指出的是，温度对分辨率的影响，是对分离因子与理论塔板高度的综合效应。因为温度升高，理论塔板高度有时会降低，有时会升高，这要根据实际情况去选择。通常，a 的变化对Rs 影响最明显。
总之，影响分离度或者说分离效率的因素是多方面的。我们应当根据实际情况综合考虑，特别是对于生物大分子，我们还必须考虑它的稳定性，活性等问题。如pH 值、温度等都会产生较大的影响，这是生化分离绝不能忽视的。否则，我们将不能得到预期的效果。
(5)正相色谱与反相色谱
正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性，因此，在这种层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中流出来。反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。
一般来说，分离纯化极性大的分子(带电离子等)采用正相色谱(或正相柱)，而分离纯化极性小的有机分子(有机酸、醇、酚等)多采用反相色谱(或反相柱)。
(6)操作容量(或交换容量)
在一定条件下，某种组分与基质(固定相)反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，我们称为操作容量(或交换容量)。它的单位是毫摩尔(或毫克)/克(基质)或毫摩尔(或毫克)/毫升(基质)，数值越大，表明基质对该物质的亲合力越强。应当注意，同一种基质对不同种类分子的操作容量是不相同的，这主要是由于分子大小(空间效应)、带电荷的多少、溶剂的性质等多种因素的影响。因此，实际操作时，加入的样品量要尽量少些，特别是生物大分子，样品的加入量更要进行控制，否则用层析办法不能得到有效的分离。
7.1.4 层析法的分类
层析根据不同的标准可以分为多种类型
①根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。纸层析是指以滤纸作为基质的层析。薄层层析是将基质在玻璃或塑料等光滑表面铺成一薄层，在薄层上进行层析。柱层析则是指将基质填装在管中形成柱形，在柱中进行层析。纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。
②根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层析和气相层析。气相层析是指流动相为气体的层析，而液相层析指流动相为液体的层析。气相层析测定样品时需要气化，大大限制了其在生化领域的应用，主要用于氨基酸、核酸、糖类、脂肪酸等小分子的分析鉴定。而液相层析是生物领域最常用的层析形式，适于生物样品的分析、分离。
③ 根据分离的原理不同分类，层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。
吸附层析是以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术。
分配层析是根据在一个有两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。
凝胶过滤层析是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。
离子交换层析是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离的一种层析技术。亲和层析是根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力(如酶和抑制剂、抗体和抗原、激素和受体等)，将某种配体连接在载体上作为固定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种层析技术。亲和层析是分离生物大分子最为有效的层析技术，具有很高分辨率。
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柱层析的基本装置及基本操作
目前，最常用的层析类型是各种柱层析，下面就简述柱层析的基本装置及操作方法，薄层层析的装置和操作将在后面详细讨论。
(1)柱层析的基本装置
柱层析的基本装置，如图2－21 。
(2)柱层析的基本操作
柱层析的基本操作包括以下一些步骤：
①装柱
柱子装的质量好与差，是柱层析法能否成功分离纯化物质的关键步骤之一。一般要求柱子装的要均匀，不能分层，柱子中不能有气泡等。否则要重新装柱。
首先选好柱子，根据层析的基质和分离目的而定。一般柱子的直径与长度比为1:10~50，凝胶柱可以选1:100～200。然后将柱子洗涤干净。
将层析用的基质(如吸附剂、树脂、凝胶等)在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸(0.5～1mol/L)、碱(0.5 ~1mol/L)、盐(0.5~1mol/L)溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质。然后用去离子水(或蒸馏水)洗涤干净并真空抽气(吸附剂等与溶液混合在一起)，以除去其内部的气泡。
关闭层析柱出水口，并装入1/3柱高的缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中，使其沉降约3cm 高。
打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液，吸附剂的多少根据分离样品的多少而定。注意不能干柱、分层，否则必须重新装柱。
最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有2~3cm 高的缓冲液，同时关闭出水口。
②平衡
柱子装好后，要用所需的缓冲液 (有一定的pH 和离子强度)平衡柱子。用恒流泵在恒定压力下走柱子，平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同。平衡液体积一般为3～5倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。如果需要，可用兰色葡聚糖2000在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。有时柱子平衡好后，还要进行转型处理，这方面的内容将会在离子交换层析中加以介绍。
③加样
加样量的多少直接影响分离的效果。一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。通常加样量应少于 20%的操作容量，体积应低于5%的床体积，对于分析性柱层析，一般不超过床体积的1%。当然，最大加样量必须在具体条件下多次试验后才能决定。
应注意的是，加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦。详细操作见层析实验。
④洗脱
当我们选定好洗脱液后，洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔(或洗脱体积间隔)也不长，采用这种方法是适宜的。但选择的溶剂必须很合适方能使各组分的分配系数较大。否则应采用下面的方法。
分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。
梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH 值等。最常用的是浓度梯度。在水溶液中，亦即离子强度梯度。可形成梯度的形式有三种，如图2－22。我们可以通过下式计算得到流经层析柱的洗脱液中盐浓度：
C = CB－( CB－CA)( 1－V2 / V1)B1 / A1
式中： C：流经层析柱的洗脱液的盐浓度；
CB：梯度混合器中B 瓶的盐浓度(不搅拌)；
CA：梯度混合器中A 瓶的盐浓度(搅拌)；
B1：B 瓶的横切面积； A1：A 瓶的横切面积；
V2：流经层析柱的洗脱液体积； V1：梯度洗脱液总体积。
图 2－22 柱层析中形成洗脱液梯度的三种形式示意图
A：混合液(低浓度盐溶液)；B：储液瓶(高浓度盐溶液)
洗脱条件的选择，也是影响层析效果的重要因素。当对所分离的混合物的性质了解较少时，一般先采用线性梯度洗脱的方式去尝试，但梯度的斜率要小一些，尽管洗脱时间较长，但对性质相近的组分分离更为有利。同时还应注意洗脱时的速率，流速的快慢将影响理论塔板高度，从而影响分辨率。事实上，速度太快，各组分在固液两相中平衡时间短，相互分不开，仍以混合组分流出。速度太慢，将增大物质的扩散，同样达不到理想的分离效果。只有多次试验才会得到合适的流速。总之，我们必须经过反复的试验与调整 (可以用正交试验或优选法)，才能得到最佳的洗脱条件。还应强调的一点是，在整个洗脱过程中，千万不能干柱，否则分离纯化将会前功尽弃。
⑤收集、鉴定及保存
在生化实验中，基本上我们都是采用部分收集器来收集分离纯化的样品。由于检测系统的分辨率有限，洗脱峰不一定能代表一个纯净的组分。因此，每管的收集量不能太多，一般1mL~5mL/管。如果分离的物质性质很相近，可低至0.5mL / 管，这视具体情况而定。在合并一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴定。例如，一个蛋白峰的各管溶液，要先用电泳法对各管进行鉴定。对于是单条带的，认为已达电泳纯，合并在一起。其他的另行处理。对于不同种类的物质采用相应的鉴定方法，在这里不再叙述。最后，为了保持所得产品的稳定性与生物活性，一般采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩，再冷冻干燥得到干粉，在低温下保存备用。
⑥基质(吸附剂、交换树脂或凝胶等)的再生
许多基质(吸附剂、交换树脂或凝胶等)可以反复使用多次，而且价格昂贵，所以层析后要回收处理，以备再用。各种基质的再生方法可参阅有关文献。