人类皮肤衰老过程的单细胞转录组全景图
文章信息
文章题目：A Single-Cell Transcriptomic Atlas of Human Skin Aging
期刊：Developmental Cell
发表日期：2021年2月8日
DOI:https://doi.org/10.1016/j.devcel.2020.11.002
摘要
不同年龄健康人类的眼睑皮肤进行单细胞测序，并鉴定出11个经典的细胞类型。basal细胞的六个亚型。深入分析发现光老化带来的变化，年龄增长，慢性炎症增加。挑出一个转录因子HES1,并在细胞水平上进行功能验证。
单细胞测序
对象
不同年龄健康人类的眼睑皮肤（双眼皮手术）
样本：分为年轻（18,22,23,25,26,27,28岁）、中年(44,47,48岁)、年老三组(70,73,76岁)
细胞：过滤后有35678个细胞
单细胞分离
剪碎样本到~1mm2，使用消化液（PBS supplemented with 2 mg/mL collagenase I, 2 mg/mL collagenase IV, 2 mg/mL dispase and 0.125% trypsin-EDTA），37℃，1h。40um 细胞筛过滤。
测序方法
10X Genomics
细胞过滤标准
保留测到的细胞基因 500-5000之间，线粒体基因小于10%。剩余35678个细胞进行进一步分析。
NormalizeData → ScaleData →CCA→ FindCluster→ RunUMAP→FindAllMarkers
结果
1 单细胞测序不同年龄的皮肤
① 图A masson染色先看不同年龄皮肤样本：表皮厚度、真皮的胶原密度随着年龄的增长而下降。图B的K10和K14染色图中，K10标记的棘状表皮和K14染色标记的基底层也说明了这一点
② 单细胞测序，11个细胞群，每个群代表的marker点状图，featureplot图，见图D-G，
年龄不同，细胞分群变化不大，见下图L,图M。Y,M,O 分别代表年轻、中年、年老组。
2 年龄变化过程中不同细胞群的基因表达的变化
探索细胞水平上的衰老机制，将每个细胞群分为Y,M,O 三组，比较他们的基因表达不同。以|avg_logFC| > 0.25 and p_val_adj < 0.05为标准，筛选出上千个DEG，见下图A,B 差不多一半的O/Y组的DEG在中年组都能检测到了，图C。PCA 分析后发现转录水平上中年组更接近老年组。说明这时候可能已经开始衰老了，图D。
对这些DEG进行深入分析，为了找到在衰老过程中连续变化的DEG，使用seurat包中的FindAllMarkers功能，顺着18, 22, 23, 44, 47, 48, 70, 73, 和 76年龄变化，研究每个细胞群的DEGs，标准 | 'avg_logFC’ | > 0.25 and 'p_val_adj’ < 0.05。然后借用monocle包中的plot_pseudotime_heatmap函数。图E中看到，7个细胞群有458个age-uprgulated DEG ，1422个 age-down-regulated DEGs。功能富集分析发现，随年龄上调变化的基因主要与细胞因子分泌信号通路和凋亡信号通路相关，随年龄下调变化的基因主要与上皮细胞增殖和ECM 组织相关的基因（图F）。
因为眼皮的暴露在光照下，与光老化密切相关。检测了年龄变化过程中，光老化相关通路与细胞群之间的关系。基因修复相关基因在BC，MC，EC，pericyte，melanocyte和fibroblast中都随着年龄下调，见下图G。DNA 氧化（8-OHdG阳性细胞） 细胞比例增加（图H）
3 六个表皮基底细胞亚群的转录变化
表皮细胞是通过基底细胞的不断再生维持稳态。皮肤衰老会对这些表皮干细胞产生怎样的影响呢？主要分析了人表皮的BC细胞。
角质细胞被分为 未分化的表皮基底细胞（BC1-3）、增殖细胞（MC）、分化的棘妆细胞（SC1-2）、终端分化细胞（GC），如下图B-G。MC还可进一步分为MC1-3。
对这些细胞进行伪时序分析，见上图H. BC1-BC3,细胞干性marker COL17A1，细胞连接相关基因（KRT14,KRT5）逐渐下降，炎性反应相关因子（S100A9,S100A8）上调（图D-F）。
4 皮肤衰老过程中表皮BC亚群中的基因变化
图C 可以看到，不不同年龄组，同的细胞亚群的DEG 大部分重合（图C，图E）。图D 是不同亚群，年龄相关的DEG
上图F 可以看到，上调的DEG 大部分集中在凋亡信号通路和细胞因子激导的免疫反应；下调的主要与上皮细胞分化和增殖有关。
接着对不同BC亚群进行转录调控网络分析，试图找出不同亚群转录调节子，如下图G。重点关注重要的KLF5和KLF6（图H,I）。图J中，衰老相关的基因β-牛乳糖酶（SA-β-gal）染色结果表明，人初代角质细胞KLF6的敲除促进衰老。KLF6的敲低可导致增殖能力下降（图K），已经促炎性因子IL表达和分泌的增加（图L，M）。这些表明，一些控制生长的TFs 随着年龄增长而下降，这可能是与表皮细胞的衰老有关。
5 人皮肤衰老过程中真皮成纤维细胞中的基因表达变化
根据以往文献对真皮fibroblast进行分类。下图A-D。图E显示，随着年龄增长papillary层厚度下降，且MFAP标记的fibroblast也减少，胶原束结构更松散无规律。图F-G显示，随着年轻增加，除了和上皮细胞一样的炎性因子分泌增长，上调最显著的是拆解ECM 的基因如MMP2。
接着注意到转录因子，下图H，HES1, IER2, ID3, TSC22D1, GADD45B, ID1 和 ZFP36 。SCENIC验证其中只有HES1被认为是核心TF （图I,J ），不仅是fibroblast，其他图中标识的细胞类型也是。HES1是notch 信号通路中关键的下游目标。
6 HES1 在真皮fibroblast的作用
为了确定人真皮衰老过程中关键因子，在初代fibroblast敲除图示基因（图A-D），显示HES1和IER2比较重要。再对敲低HES1的初代真皮fibroblast进行RNA seq比进行GO富集。结果如图E-F，与眼皮单细胞测序的fibroblast 结果相似，表明HES1可能是生理上fibroblast衰老的重要驱动子。
接着验证HES1在细胞水平上对衰老的作用。在人fibroblast中过表达HES1后，细胞增殖提高且衰老变慢，图G-J。quercetin 延缓UV辐射介导的人初代真皮fibroblast和HES1-deficient 的人初代真皮fibroblast衰老（图K）
小结
本文对不同年龄的人上眼皮细胞进行测序，通过年龄分组查看不同细胞亚群的差异基因。找到一个基因HES1，在细胞水平上进行验证。难度不是很大，比较完整。