每月一生信流程之rnaseqDTU（差异转录本）
每月一生信流程栏目灵感来自于《铁汉1991》博客的《每日一生信》，他那个时候介绍的主要是生信基础知识，包括数据结构，数据格式，数据库资源，计算机基础等等，所以每天都可以进步，每天都有成果。这些基础知识已经被分享的七七八八了，所以我这里推陈出新，来一个每月一生信流程，陪生信技能树的粉丝们一起进步！
上一期我们推荐的是转录组经典表达量矩阵下游分析大全 本期我们聊聊可变剪切，流程里面写的差异转录本，或者差异外显子，都差不多的意思。
全部bioconductor流程链接在；http://www.bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#___GeneExpressionWorkflow 目前的27个流程，已经分门别类的整理好了，我们每个月学一个流程，预计两年就可以成为生物信息学领域的全栈工程师啦！
一图看懂DGE, DTE and DTU
参考文献：F1000Research 2019, 8:213 Last updated: 18 MAR 2019
今天学习rnaseqDTU
我们首先看看转录组领域的基因表达相关流程吧，首先一起学习的是Swimming downstream: statistical analysis of differential transcript usage following Salmon quantification
http://www.bioconductor.org/packages/release/workflows/vignettes/rnaseqDTU/inst/doc/rnaseqDTU.html
这个就没有中文版了，实际上是使用salmon软件把我们的RNA-seq测序的fastq数据根据参考转录组进行定量后，走几个R包流程。
在R里面安装这个bioconductor流程
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("rnaseqDTU")
因为原文写的实在是太详细了，我这里就不拷贝粘贴了，大家直接去阅读即可：
RNA-seq workflow for differential transcript usage following Salmon quantification
http://www.bioconductor.org/packages/release/workflows/vignettes/rnaseqDTU/inst/doc/rnaseqDTU.R
全部目录如下；
3 Methods
3.1 Simulation
3.2 Operation
3.3 Quantification and data import
3.4 DTU testing
4 Workflow
4.1 Salmon quantification
4.2 Importing counts into R/Bioconductor
4.3 Transcript-to-gene mapping
5 Statistical analysis of differential transcript usage
5.1 DRIMSeq
5.2 stageR following DRIMSeq
5.3 Post-hoc filtering on the standard deviation in proportions
5.4 DEXSeq
5.5 stageR following DEXSeq
5.6 Citing methods in published research
6 DTU analysis complements DGE analysis
6.1 DGE analysis with DESeq2
6.2 DGE analysis with edgeR
6.3 End of workflow section
流程代码
首先是salmon的：
salmon quant -i $index -l A -1 $fq1 -2 $fq2 -p 4 -o quants/${sample}_quant
每个样本的fq测序数据都会被
然后把所有的样本的quant.sf文件批量读取到R里面：
rm(list = ls())
options(stringsAsFactors = F)
library(rnaseqDTU)
library(tximport)
files=list.files('quants/',pattern = 'quant.sf',recursive = T,full.names = T)
txi <- tximport(files, type="salmon", txOut=TRUE,
countsFromAbundance="scaledTPM")
cts <- txi$counts
cts <- cts[rowSums(cts) > 0,]
library(GenomicFeatures)
# 文件 gencode.v32.annotation.gtf.gz 自己在gencode数据库网页下载即可
gtf <- "../database/gencode/gencode.v32.annotation.gtf.gz"
txdb.filename <- "gencode.v32.annotation.sqlite"
txdb <- makeTxDbFromGFF(gtf)
saveDb(txdb, txdb.filename)
txdb <- loadDb(txdb.filename)
txdf <- select(txdb, keys(txdb, "GENEID"), "TXNAME", "GENEID")
tab <- table(txdf$GENEID)
txdf$ntx <- tab[match(txdf$GENEID, names(tab))]
cts[1:3,1:3]
range(colSums(cts)/1e6)
head(txdf)
cts=cts[rownames(cts) %in% txdf$TXNAME,]
dim(cts)
txdf <- txdf[match(rownames(cts),txdf$TXNAME),]
all(rownames(cts) == txdf$TXNAME)
counts <- data.frame(gene_id=txdf$GENEID,
feature_id=txdf$TXNAME,
cts)
save(counts,files,file = 'salmon-out.Rdata')
上面整理salmon结果的代码，看起来很复杂，其实修改的地方不多，值得注意的是：
表达矩阵的第一列是基因的ID,第二列是转录本的ID，后面才是表达量哦。
有一个分组信息，我这里并没有给出我的代码，因为每个人的项目不一样，你需要自己制作，但凡有点R语言基础的，都是没有问题啦。就是 samps 那个变量的内容，有了它，下面的DRIMSeq流程分析差异转录本表达量才有意义。
接着运行DRIMSeq流程即可：
library(DRIMSeq)
d <- dmDSdata(counts=counts, samples=samps)
d
counts(d[1,])[,1:4]
n <- 12
n.small <- 6
d <- dmFilter(d,
min_samps_feature_expr=n.small, min_feature_expr=10,
min_samps_feature_prop=n.small, min_feature_prop=0.1,
min_samps_gene_expr=n, min_gene_expr=10)
d
table(table(counts(d)$gene_id))
design_full <- model.matrix(~condition, data=DRIMSeq::samples(d))
colnames(design_full)
table(samps$condition)
set.seed(1)
system.time({
d <- dmPrecision(d, design=design_full)
d <- dmFit(d, design=design_full)
d <- dmTest(d, coef="conditionControl")
})
res <- DRIMSeq::results(d)
head(res)
res.txp <- DRIMSeq::results(d, level="feature")
head(res.txp)
no.na <- function(x) ifelse(is.na(x), 1, x)
res$pvalue <- no.na(res$pvalue)
res.txp$pvalue <- no.na(res.txp$pvalue)
save(d,res,res.txp,file = 'DRIMSeq-out.Rdata')
是不是非常简单，就拿到了全部的转录本水平的差异表达 呢，还可以可视化如下：
可以看到，我举例的这个项目里面，tumor和control组的样本量是不平衡的，而且基因ID也不容易理解，大家可以自行转换为基因的symbol，这样出图更直观。
学习这样的流程是需要一定背景知识的
首先是LINUX学习
我在《生信分析人员如何系统入门Linux(2019更新版)》把Linux的学习过程分成6个阶段 ，提到过每个阶段都需要至少一天以上的学习：
第1阶段：把linux系统玩得跟Windows或者MacOS那样的桌面操作系统一样顺畅，主要目的就是去可视化，熟悉黑白命令行界面，可以仅仅以键盘交互模式完成常规文件夹及文件管理工作。
第2阶段：做到文本文件的表格化处理，类似于以键盘交互模式完成Excel表格的排序、计数、筛选、去冗余，查找，切割，替换，合并，补齐，熟练掌握awk,sed,grep这文本处理的三驾马车。
第3阶段：元字符，通配符及shell中的各种扩展，从此linux操作不在神秘！
第4阶段：高级目录管理：软硬链接，绝对路径和相对路径，环境变量
第5阶段：任务提交及批处理，脚本编写解放你的双手
第6阶段：软件安装及conda管理，让linux系统实用性放飞自我
然后是R学习
我在在生信分析人员如何系统入门R(2019更新版) 里面给初学者的知识点路线图如下：
了解常量和变量概念
加减乘除等运算（计算器）
多种数据类型（数值，字符，逻辑，因子）
多种数据结构（向量，矩阵，数组，数据框，列表）
文件读取和写出
简单统计可视化
无限量函数学习
必备书籍及视频
书籍贪多不烂，下面2本必买，读5遍以上：
视频必须强推生信技能树近30万学习量的基础合辑：
生信技能树可变剪切相关教程节选
因为做目录确实很浪费时间，差不多就下面这些，大家先学习吧：