3D 细胞培养第一步，5 种基质胶包被方法要选对
在 3D 细胞培养大行其道的今天，基底膜提取物（BME）作为维持细胞稳定生长和健康状态的支架，其重要性不言而喻。计划开展实验时，问题也接踵而来：
BME 的基本成分是什么？
BME 包被细胞的方法有哪些？
不同的细胞培养应选择什么包被方法？
操作时有哪些注意事项……
本文重点以 Cultrex® BME 为例，为你一一解惑。更有现货产品助您顺利开展类器官实验，了解更多产品信息可点击阅读原文联系各地经销商获取。
什么是基底膜提取物
基底膜提取物（BME），又称为基底膜基质或基底膜基质胶，是一种商业上销售的、包含有细胞外基质（ECM）的基质胶，其中包含胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖等成分。
BME 是从 Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤组织中纯化而来的，为细胞粘附和细胞结构提供了底物，还可以为细胞间相互作用提供优化的环境，促进类似体内的 2D 和 3D 生长动态。同时，也可以通过更多的纯化步骤来生成低生长因子（RGF）版本的 BME，适合限定培养条件的应用，如多能干细胞的扩增和分化或类器官的培养。
细胞培养中细胞外基质的关键特征
由于 BME 有着独特的物理特性：在 2~8 °C 时呈现液态，而在室温或 37 ℃ 时迅速固化，液态的 BME 可以轻松操作和稀释，但是 2~8 °C 以上的温度波动或短暂暴露都会影响 BME 的物理性质，因此最佳做法是始终保持低温或置于冰上。以 Bio-Techne 的 Cultrex® BME 为例，在处理时，应注意：
将所有储液放置在 -80 °C 长期保存（1 个月以上）；
将冷冻的 Cultrex BME 置于 2~8 °C 的冰箱内，在冰上过夜解冻，这样可以充分融化，同时让产品保持在稳定的低温环境；
按每次使用量分装，将分装产品放置在 -80 °C 长期保存；
将所有储液放置在 -80 °C 长期保存（1 个月以上）；
切勿在 2~8 °C 保存 Cultrex® BME 超过一天；
如果温度超过 18 °C，Cultrex® BME 将会变成凝胶，因此必须始终置于冰上，并使用预冷的耗材和工具（如移液吸头），且动作要快；
始终使用预冷的细胞培养基稀释 Cultrex® BME。
选择合适的 BME 包被方法
BME 可用于多种细胞培养，而各种包被方法应该如何选择，取决于起始材料的类型（单个细胞或组织）、您感兴趣的细胞或组织的粘附要求，以及 2D 或 3D 培养体系的需求等。
例如，胚胎或诱导多能干细胞（ES/iPSC）的扩增或分化可采用不同方法包被。Cultrex® BME 的薄层包被提供了基本底物，可以支持无滋养层的多能干细胞扩增。而在将干细胞分化成终末细胞类型时，有时会采用夹心包被法，也就是将细胞嵌在两层 BME 之间。
对于需要额外粘附支持的培养物（比如 iPSC 来源的可收缩的心肌细胞），这种方法特别理想。其他方法，如厚层包被、包埋和圆顶包埋方法，常用于更复杂的 3D 培养系统（表 1）。
表 1. Cultrex® BME 包被方法说明
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方法 |
说明 |
应用 |
建议使用的 Cultrex BME |
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薄层 包被 |
细胞生长在薄薄一层 Cultrex BME 的表面 |
· 原代细胞增殖 · iPSC 扩增 |
· Stem Cell Qualified Cultrex RGF BME（货号 3434-005-02） · Cultrex RGF BME（货号 3433-005-01） · Cultrex BME（货号 3432-005-01） |
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厚层 包被 |
细胞生长在厚厚一层 Cultrex BME 的表面 |
· 管腔形成 |
· Cultrex RGF BME（货号 3433-005-01） · Cultrex 3-D RGF BME（货号 3445-005-01） |
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夹心法 |
细胞夹在两层厚厚的 Cultrex BME 之间培养 |
· iPSC 分化 |
· Stem Cell Qualified Cultrex RGF BME（货号 3434-005-02） · Cultrex RGF BME（货号 3433-005-01） |
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层次 包埋 |
将细胞包埋在 Cultrex BME 中培养 |
· 球状体培养 |
· Cultrex 3D RGF BME（货号 3445-005-01） · Cultrex RGF BME, Type 2（货号 3533-005-02） · Cultrex RGF BME, Type R1（货号 3433-005-R1） |
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圆顶 包埋 |
将细胞包埋在 Cultrex BME 中培养，然后以圆顶结构形式铺在细胞培养容器中 |
· 类器官培养 |
· Cultrex RGF BME, Type 2（货号 3533-005-02） · Cultrex RGF BME, Type R1（货号 3433-005-R1） |
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薄层包被法
Cultrex® BME 的薄层包被法为细胞增殖和维持提供了附着的 ECM 底物。它通常用于胚胎干细胞和诱导多能干细胞的扩增，也广泛应用于细胞系或原代细胞。
简单地说，这种方法是用预冷的细胞培养基来稀释预冷的 Cultrex BME，将溶液移液至培养皿中，然后在 37 °C 下孵育至少 30 分钟来固化基质。悬浮在培养基中的细胞被接种到各孔中，之后它们附着在薄层包被的 Cultrex® BME 上。这种包被方法的优势是操作简单，适用于下游的免疫细胞化学和细胞成像应用。
薄层包被快速操作
利用薄层包被法培养诱导多能干细胞。图像显示了利用 Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME（货号 3433-005-01）培养的 iPSC 克隆。细胞经过 SOX1（红色）、E-Cadherin（绿色）和 DAPI（蓝色）染色。
厚层包被法
与薄层包被法相比，厚层包被法使用更高浓度的未稀释 Cultrex® BME，能够促进与体内更类似的细胞行为，特别适合 3D 结构的形成，比如血管生成研究中主动脉环和内皮细胞管腔形成。
这种方法直接将预冷的 Cultrex® BME 铺在细胞培养容器中。将培养板置于 37 °C 孵育 30 分钟，让基质固化。悬浮在培养基中的细胞被接种到各孔中，之后它们附着在厚层包被的 Cultrex® BME 上。
厚层包被快速操作
利用厚层包被法形成内皮细胞管腔结构。收集人脐静脉内皮细胞（HUVEC）并计数，用内皮细胞基础培养基（不含血清或血管生成因子）或内皮细胞生长培养基（含有支持 HUVEC 扩增的所有添加剂和生长因子）来稀释细胞。将 HUVEC（1x104 个细胞/孔）接种在凝胶状的 Cultrex® RGF BME（货号 3433-005-01）上，然后在 37°C 和 5% CO2 中培养四小时。图中呈现了在基础培养基（左）和生长培养基（右）中培养的 Calcein AM（货号 4892-010-01）染色细胞的代表性图像。
夹心包被法
Cultrex® BME 的夹心包被法提供了一个更复杂的 ECM 微环境，让细胞在更类似体内的 3D 环境中生长和分化。
在使用夹心包被法时，先用薄层包被法包被培养板。当细胞附着在培养板上之后，用另一层稀释的 Cultrex® BME 覆盖细胞。在这一层固化后，在各孔中加入培养基，培养细胞，直至出现所需的表型。尽管该过程比薄层包被法复杂，但细胞完全包埋在基质中，带来了更刚性的 3D 支架环境。
夹心法包被快速操作
利用夹心包被法将多能干细胞分化成心肌细胞。利用 StemXVivo® Cardiomyocyte Differen-tiation Kit（货号 SC032B），采用夹心法将 JOY6（左图）和 iBJ6（右图）人诱导多能干细胞分化成心肌细胞。除了肉眼观察到可收缩的细胞，心肌细胞命运的决定可通过人心肌肌钙蛋白 T（红色）来评估。利用 DAPI（蓝色，货号 5748）对细胞核进行复染。
包埋法
在包埋法中，细胞被 Cultrex® BME 基质胶完全包围，与其他包被方法相比，它在更类似体内的微环境中促进细胞扩增和成熟。包埋法的最常见应用包括：
球状体的侵袭或侵袭实验，可模拟肿瘤发生和肿瘤细胞转移；
类器官或迷你器官的形成，如肠、脑、肝、肾和胰腺。
1、层次法
简单地说，将预冷的 Cultrex® BME 与肿瘤细胞系、原代组织碎片或诱导多能干细胞直接混合。将该混合物直接铺在所需的细胞培养容器内。将培养板置于 37 °C 孵育 30 分钟，让基质固化。然后在固化的 Cultrex BME/细胞混合物的上面加入培养基。这种方法常用于类器官、球状体的形成，以及细胞侵袭和迁移实验。
层次包埋快速操作
包埋在 Cultrex® BME 的球状体用于细胞侵袭和迁移实验。在低吸附力的培养板上培养 MDA-MB-231（3,000 个细胞/孔）达 72 小时，形成球状体。然后将球状体包埋在 A) 无基质，B) 10 mg/mL Cultrex BME 或 C) 10 mg/mL Cultrex BME 和 1 mg/mL I 型胶原蛋白中。在基质胶固化后，向每孔中加入 DMEM、10% FBS，以促进 96 小时的趋化反应。请注意，Cultrex® BME 和 ECM 的选择影响了细胞侵袭和迁移的程度。
2、圆顶法
将 Cultrex® BME 与类器官（1x104 个类器官/mL 或 500 个类器官/50 μL）直接混合。将 50 μL Cultrex® BME/类器官混合物分配至 24 孔板的每孔中央（如图），或在 6 孔板的每孔中放置 6~8 个圆顶结构。将培养板置于 37 °C 孵育 30 分钟，让基质固化，然后向每孔中加入适当的细胞培养基。
圆顶包埋快速操作
将未分化的人胃类器官包埋在 Cultrex® BME 的圆顶内。 按照人胃类器官培养方案，利用 Cultrex® RGF BME（货号 3533-005-02）培养的未分化人胃类器官的代表性明场图像。
不同的类器官培养方法不同，同样的类器官不同实验室也会有所差异。在开展实验之前，我们需要根据各自的实验目的，查询文献并进行培养方法的优化，选择合适的 BME 包被/包埋方法。
类器官研究专用 Cultrex BME 2 型（货号 3533-005-02/ 现货 3533-010-02）文献引用率高，代表高分同行评审文献：（下滑查看更多）
· Hubrecht 研究所
Artegiani, B. et al.(2019) Probing the Tumor Suppressor Function of BAP1 in CRISPR- Engineered Human Liver Organoids.Cell Stem Cell 24:927.
· 斯坦福大学
Co, J. et al.(2019) Controlling Epithelial Polarity: A Human Enteroid Model for Host- Pathogen Interactions.Cell Reports 26:2509.
· Gurdon 研究所
Broutier, L. et al.(2017) Human Primary Liver Cancer-derived Organoid Cultures for Disease Modelling and Drug Screening.Nature 23:1424.
· 加州大学洛杉矶分校
Phan, N. et al.(2019) A Simple High-throughput Approach Identifies Actionable Drug Sensitivities in Patient-derived Tumor Organoids.Communications Biology 2:78.
图文来源：Bio-Techne