细胞外基质辅以VEGF可诱导人诱导性多能干细胞内皮分化
了解生理/病理状态下的组织形成和重建过程中，细胞和细胞外基质（ECM）之间的相互作用，对于开发再生疗法和理解体外疾病模型至关重要。ECM通过基质结构、结构蛋白和功能基质组分（如生长因子），为细胞提供生长空间及化学/功能引导。脱细胞ECM（dECM）被认为是可有效促进组织再生的材料，应用于组织再生中。
肾脏具有复杂的组织结构，主要体现为复杂的ECM结构。在急性和慢性肾脏疾病中，肾脏结构在组织重建时会受到损害，通常导致大规模纤维化，最终导致肾功能完全丧失。虽然肾脏有一定的内源性再生能力，但这种能力不足以预防慢性肾功能衰竭。肾脏dECM已经被应用于肾脏的修复研究中。
鉴于肝素结合生长因子（HBGFs）是dECM中高度灵活的调节成分，可与细胞膜受体直接相互作用，以及血管在肾脏功能和分化中的作用，德国柏林夏里特大学Andreas Kurtz教授团队检测了dECM及其中相关因子、血管内皮生长因子VEGF对人类诱导多能干细胞（hiPSC）向内皮细胞分化的调节作用。结果表明，清除HBGFs或ECM中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）会削弱dECM对hiPSC分化的诱导作用；相反，补充VEGF会增强dECM上hiPSC向成内皮细胞的分化。
研究者首先获取了病人的肾脏并进行脱细胞处理。处理后的dECM，基本保留了ECM蛋白。虽然HBGFs的含量显著下降了50%以上，但各因子均有一定程度的保留(图1)。
Fig. 1 Characterization of decellularized human kidney ECM.
研究者接着分别用肝素酶（dECM-HSPG组）和NaCl（dECM-HBGF组）去除dECM中的HSPGs和HBGFs，发现这两者的去除几乎完全消除了dECM中的VEGF。用20ng / ml的VEGF 165（dECM VEGF）补充到dECM中，发现VEGF会优先与dECM中具有更高VEGF水平的区域结合，尤其是在毛细血管密度高的肾小球区域(图2 I, K)，补充到dECM、dECM-HSPG 和dECM-HBGFs的VEGF在10天内相对稳定(图2 L)。
Fig. 2 Heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) and VEGF concentrations in dECM before and after HBGF and HSPG depletion.
为了检测hiPSC分化为内皮细胞(EC)是否依赖于dECM结合的VEGF，研究者将hiPSC分别接种于dECM、dECM VEGF、dECM-HSPG和dECM-HBGF上，采用不含生长因子的APEL2 PFHMII培养基培养。阳性对照组中，将hiPSC接种到常规hiPSC培养基材Geltrex上，采用标准培养基并添加VEGF进行培养(G 组)。在第0天（接种hiPSC后8小时）开始中胚层诱导。在G 标准对照条件下，第3天至第4天出现中胚层细胞。在第5天，在dECM VEGF上观察到CD144表达，但在其他组均未观察到CD144表达（图3AE）。在第7天，除了dECM-HBGF和dECM-HSPG（图3G、I、M、N），其他各组均有CD144（图3F J）和CD31（图3K、O）的表达。在第10天，内皮标志物在所有条件下表达，但在dECM-HSPG和-dECM-HBGF组中仅以非常低的水平表达（图3P、Y）。
为了量化表达内皮细胞标志物的细胞百分比，研究者在每个分组中随机选择50个区域，计算了表达内皮细胞标志物CD144和CD31的细胞数量（图 3Z）。结果表明，在dECM中添加VEGF后的dECM可以促进hiPSC的诱导分化。诱导的内皮细胞出现的速度甚至比阳性对照组G 更快。
Fig. 3 Differentiation of hiPSC to endothelial cells on different matrices.
为了证实去除HSPG和HBGF以及补充血管内皮生长因子(VEGF)对dECM的影响，研究者考察了HUVEC的生存能力和代谢活性。结果表明，HUVECs大部分位于肾小管和血管层粘连蛋白丰富的基质结构上，或位于毛细血管丰富的肾小球内，而在无基质成分的腔内区很少发现细胞。这种特异性在dECM VEGF中最为明显，而在dECM- HSPG中，细胞随机附着 (图4)。
Fig. 4 Recellularization of dECM and geltrex with HUVEC. Sections were analyzed 5 days after seeding of HUVEC by DAPI (blue) and laminin (red) staining.
本研究由德国柏林夏里特大学Andreas Kurtz教授团队完成，并于2019年6月18日在线发表于Biomaterials。
论文信息：
Imran Ullah, Raed Abu-Dawud, Jonas Felix Busch, Anja Rabien, Bettina Erguen, Iris Fischer, Petra Reinke, Andreas Kurtz*. VEGF-Supplemented extracellular matrix is sufficient to induce endothelial differentiation of human iPSC. Biomaterials 2019, DOI: 10.1016/j.biomaterials.2019.119283.
论文链接：
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2019.119283
供稿：余颖康
审校：过倩萍
编辑：张维东