前交叉韧带重建（ACLR）是骨科运动医学中常用的手术方式。随着外科技术的进步提供了更好的移植物定位和固定。手术失败也大多数是因为移植物愈合不良所导致的。尽管在不同的临床和动物研究中尝试了不同的生物学方法来促进移植物愈合，但尚未实现移植物完全融合进骨隧道和关节内部分。基于对移植物愈合过程及其失效机制的理解，本综述旨在结合已知的基础科学和临床证据，对移植物愈合过程中遇到的障碍进行更清晰的描述，以利于研究者们继续研究促进前交叉韧带（ACL）移植物愈合起到理论支持的作用。据统计，美国每年发生200000例前交叉韧带（ACL）损伤，其中每年约有60000至150000例需要进行前交叉韧带重建（ACLR）。然而，这种常用外科手术的移植物失败率仍然相当高，有研究报告显示高达13.3%。有研究证据表明，尽管外科技术有所进步，康复方案得到优化，但是移植物的不良愈合仍然是失败的促成因素之一。前期研究已对前交叉韧带（ACL）移植物在不同阶段的愈合过程进行了不同方式的临床和生物学评估。临床上采用了不同的影像学技术、关节镜检查和活检来检测肌腱移植物在前交叉韧带重建（ACLR）手术后的变化。同时，大量的组织学和生物化学临床前研究表明，前交叉韧带（ACL）重建后肌腱移植物的分子和细胞反应不同。前交叉韧带重建（ACLR）中的移植物愈合通常分为3个阶段，即早期愈合、增殖和成熟阶段。早期愈合阶段的特征是移植物坏死和纤维素减少，没有发生任何明显的可检测到的血管重建，随后是细胞浸润最强烈的增殖阶段，最后是基质重塑缓慢的成熟阶段。对于使用游离肌腱移植物的前交叉韧带重建（ACLR），从未真正观察到骨隧道内移植物的完全隧道闭合和骨化，而是仅仅发现某些移植物结合到隧道壁中的夏普氏纤维或仅通过纤维软骨区。此外，也不能完全实现移植物的关节内区域中的生物学变化，其被描述为“连接化”。因此，多年来，不同的研究人员一直倡导不同的生物调节，以改善移植物愈合，从而改善最终的临床结果。成功的前交叉韧带重建（ACLR）的肌腱移植需要肌腱移植物在骨隧道中牢固愈合，并在手术后尽快在移植物的关节内区域完全“融合”。增强肌腱移植物的愈合对于促进早期积极的康复和快速恢复完全活动至关重要。在系统回顾以往所有关于前交叉韧带（ACL）移植物愈合研究的临床证据的基础上，该研究团队提出重建后前交叉韧带（ACL）移植物愈合全过程的更清晰图景，其实际上是在移植物的不同区域、不同时间点发生的大量分子和细胞事件，导致原始肌腱发生顺序性变化，从而成为新的前交叉韧带（ACL）。因此，了解所有这些事件的规律及其在康复期间的临床相关性非常重要，有助于确定未来的研究方向和正确的目标，促进移植物愈合，从而改善最终临床结果。
1.移植物愈合不良将会导致前交叉韧带重建（ACLR）失败
目前尚不清楚前交叉韧带（ACL）移植物植入后失败的真实发生率，尽管有研究报道高达24.4%。大多数研究报告的移植物失败率在0.7%~14%之间。最近的几项系统综述报告的失败率分别为3.6%、4%和5.8%。匹兹堡大学的一项研究表明，单束前交叉韧带重建（ACLR）后，翻修手术时最常见的破裂模式是近端破裂，其次是中间物质破裂。他们还将前交叉韧带重建（ACLR）失败的机制分类为与（a）手术技术有关，（b）移植物有关，（c）外伤。此外，多中心前交叉韧带（ACL）修订研究（MARS）小组开展了一项多外科医生、多中心的前瞻性纵向研究，MARS队列（460名患者）显示了修订外科医生认为的失败病因，包括创伤、技术、生物学等。
由于手术技术和康复方法取得了进展，当前交叉韧带重建（ACLR）后发生移植物衰竭而无创伤性事件时，应考虑移植物愈合是有问题的。因此，需要更好地了解生物愈合过程。
临床上，核磁共振成像（MRI）是监测前交叉韧带重建（ACLR）后愈合过程最常用的成像技术。Howell等人进行了第一项前瞻性研究，连续观察了前交叉韧带（ACL）自体移植物在植入第一年的MR表现。开发了基于移植物MR信号的四级分级系统，据报告，磁共振移植物信号的增加呈时间依赖性，到3个月时已完全建立，1年时保持不变。MR信号增强被认为与代表移植物水肿的水浓度增加有关。后来，Howell团队还设计了一项研究，通过T1加权核磁共振成像（MRI）评估给予Gd-DPTA造影剂后的血管重建程度。植入2年期间，未植入的前交叉韧带（ACL）移植物未获得可辨别的血供，如果韧带周围软组织血管丰富，则在1个月时覆盖移植物。然而，Biercevicz等人发现，使用信号强度（SI）作为结果测量因其对图像采集参数和扫描仪制造商的依赖而受到限制。随后，Li等人评估了在前交叉韧带重建（ACLR）后的第3、6和12个月时前交叉韧带（ACL）移植物的MRI信号（高移植物SI表示高值，表示移植物成熟度较低），并证明移植物值与术后12至114个月的术后时间呈显著负相关。最近，随着对增强前交叉韧带（ACL）移植物愈合的生物治疗的兴趣增加，临床上需要改进定量MRI测量以跟踪愈合过程。MRI超短回波时间T2（UTE-T2）对胶原基质的完整性和组织结构很敏感。Chu等人表明，定量MRI超短回波时间T2（UTE-T2）和T2作图提示术后前6个月移植物内存在实质性变化，移植物成分从6个月到1年相对稳定，符合重塑，随后从1年到2年减少，提示继续成熟。如上所述，由于采集和解释方法的广泛异质性，各研究之间的核磁共振成像（MRI）结果存在很大差异，这将阻碍信号强度（SI）的比较。然而，仍可根据该核磁共振成像（MRI）证据得出愈合过程的时间范围，客观的移植物愈合定量核磁共振成像（MRI）生物标志物对于进一步研究是可取的。
图1：核磁共振成像(MRI)显示人类移植物的愈合时间框架。
图2：A：植入后1周，整个移植物的MR信号正常（I级）。B：到3个月时，移植物从近端关节内区（1）的股骨隧道中退出，保持不变（I级）；中间关节内区（2）信号增强，约占移植物宽度的50%（Ⅱ级）；远端关节内区（3）只有几股正常的韧带，超过50%的韧带信号增强（III级）。胫骨隧道内的移植物部分（4）外观正常（I级）。C：移植物的MR信号增加持续了1年，没有恢复正常的迹象。
建议使用计算机断层扫描（CT）评估前交叉韧带（ACL）移植物愈合期间的骨隧道变化，因为普通X光片通常难以可靠地识别隧道并测量隧道宽度。Suzuki等人评估了在通过计算机断层扫描（CT）使用骨-髌腱-骨（BTB）移植物进行前交叉韧带重建（ACLR）后8周，骨栓塞几乎完全整合到矩形股骨隧道中。Christian Fink等人连续使用计算机断层扫描（CT）监测2年内的变化时间进程。与所有其他时间间隔相比，术后前6周内隧道大小变化的百分比显著较高，1年后隧道大小几乎稳定。对于自体腘绳肌腱，平均随访10个月，计算机断层扫描（CT）显示股骨隧道直径增加3%，可显示硬化的隧道边界。还使用计算机断层扫描（CT）成像比较了不同隧道放置方法和不同固定方法的加宽程度。此外，低骨矿物质密度（BMD）可能增加前交叉韧带重建（ACLR）后发生膝关节骨性关节炎的风险，而这是常规计算机断层扫描（CT）无法检测到的。外周定量计算机断层扫描（pQCT）不仅可捕获骨矿物质含量，还可捕获与骨强度直接相关的体积骨小梁和皮质骨微结构。该研究团队可以看到，常规计算机断层扫描（CT）和外周定量计算机断层扫描（pQCT）可检测前交叉韧带重建（ACLR）手术后骨变化的特性，而研究人员发现，双能量计算机断层扫描（DECT）可通过生成宝石光谱成像（GSI）图像并创建材料特异性颜色映射和双能量骨去除来评估软组织变化。因此，随着计算机断层扫描（CT）技术的发展，该研究团队有可能同时高精度地评估骨和软组织的变化。图3：矢状面隧道扩大。L1：胫骨平台；L4：骨块近端；L2：L1～L4的33%；L3：L1～L4的66%；L5：大于或等于L1～L4的33%。由于核磁共振成像（MRI）和计算机断层扫描（CT）等非侵入性方法提供的愈合状态仍然有限，因此前交叉韧带重建（ACLR）后的膝关节镜检查是提供前交叉韧带（ACL）移植物（如滑膜化和血管化）有价值信息的最可靠检查类型之一。Nakamae等人表明，前交叉韧带重建（ACLR）18个月后使用膝关节镜检查，移植物的滑膜覆盖率明显更好。滑膜化在移植物愈合中起着重要作用，被认为对移植物的存活有积极影响。有研究报告称，根据术后关节镜检查评估，与软组织同种异体移植物相比，腘绳肌自体移植物显示出明显更好的滑膜覆盖率。此外，关节镜已成为获取活检样本进行检查的工具，以研究愈合过程。通过术后关节镜检查期间的活检样本程序进行组织学检查，以研究前交叉韧带（ACL）同种异体移植物的长期愈合情况。在6个月内，表面血流量显著高于对照前交叉韧带（ACL），并从术后6个月开始随时间下降，到12个月时达到平稳状态，并维持在与正常前交叉韧带（ACL）相当的水平。在24-30、36-45、48-89个月移植物中，与正常对照前交叉韧带（ACL）的血流值相比，具有统计学意义。在组织学上，第24–89个月时的标本与第18个月时的标本非常相似，表明同种异体移植物在术后18个月时已经达到稳定性，并在此后保持存活。除滑膜化和血管化外，前交叉韧带重建（ACLR）后的神经支配也引起了研究者的兴趣。然而，使用跟腱进行前交叉韧带重建（ACLR）后的活检显示，仅在对照组和同种异体跟腱移植组的HE染色上发现神经组织类似物，未观察到机械感受器。尽管关节镜下活检可显示愈合过程中血管、神经和其他细胞水平的变化，但这是一种侵入性技术，不能经常对愈合过程进行随访。
图4：前交叉韧带重建(ACLR)术后，通过关节镜检查观察重建的前交叉韧带(ACL)。前交叉韧带(ACL)移植物的滑膜覆盖率分类如下：（a）良好（滑膜覆盖率>80%），（b）一般（50-80%）和（c）较差（覆盖率<50%）。
尽管核磁共振成像（MRI）和计算机断层扫描（CT）以及关节镜检查评估等不同成像技术已被广泛用于评估前交叉韧带（ACL）移植物愈合情况，但移植物愈合情况的最确凿证据仍取决于组织学和生物化学评估。多年来，已有大量科学工作研究前交叉韧带重建（ACLR）后不同时间点，移植物不同部位发生的移植物愈合的不同细胞生化反应。一些文献将移植物愈合过程定义为几种生物学事件的结合，包括炎性反应、移植物坏死、血管重建、细胞再增殖、骨整合、胶原重塑和连接化。这些生物学事件可分为3个不同的愈合阶段，即早期愈合、增殖和成熟阶段。肌腱移植物手术植入后的早期细胞反应涉及宿主炎性细胞的积聚。移植物植入后不久，中性粒细胞和巨噬细胞被募集到植入的移植物外周，各种细胞因子如白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β（TGF-β）等被释放。也有研究表明，前交叉韧带重建(ACLR)后细胞释放的基质金属蛋白酶-1，13 (MMP-1，13)水平升高，这将消化胶原蛋白并帮助重新填充的细胞浸润。与此同时，研究人员一致认为，肌腱移植物主要在其中心部分发生缺血性坏死。作为这一坏死过程的一部分，释放了几种细胞因子，并启动了指导不同后续步骤的生长因子级联反应。与内侧隧道部分不同，关节内物质暴露于滑液，其中含有大量干扰愈合机制的催化酶、细胞因子和生长因子抑制剂。这种差异可能导致肌腱移植物的坏死，在早期愈合阶段关节内部分中的胶原紊乱（崩解、碎裂、解体）、粘液样变性，如果随后的愈合过程未被优化，其可导致不良的愈合结果。在前交叉韧带重建（ACLR）后的早期愈合阶段，细致地了解生化和细胞反应很重要，因为许多外科医生赞成在前交叉韧带重建（ACLR）后立即提供非甾体抗炎药（NSAID）或选择性COX-2抑制剂，以尽量减少术后症状（如：疼痛和肿胀）。然而，最近的一项系统性综述表明，选择性COX-2抑制剂可能会对愈合过程产生负面影响，尽管其他一些研究表明没有负面影响。这就是为什么在前交叉韧带重建(ACLR)后给予非甾体抗炎药（NSAID）或选择性COX-2抑制剂时，外科医生需要注意的原因。临床医师要尽可能在保持非甾体抗炎药（NSAID）或选择性COX-2抑制剂的持续时间和剂量短和低的同时，避免对移植物产生不良影响。由于前交叉韧带（ACL）移植物在植入后会发生坏死，因此充分的血运重建对于移植物成功愈合至关重要，良好的血运将充分地允许细胞再增殖和随后的基质重塑。血运重建过程不足将导致细胞缺乏可用的氧，从而阻碍细胞的再增殖。研究人员强调了自体移植物的血液供应和血运重建在维持移植物活力方面的重要性。血管向内生长最早在3周形成，甚至浸润自体移植物的中心部分。提示滑膜、髌下脂肪垫和假性韧带黏液可形成新的血管。血管内皮生长因子（VEGF）的表达伴随着血管密度的升高。体内观察到的血管内皮生长因子（VEGF）产生可能是由肌腱移植物中先前的炎性反应诱导的。替代细胞来自于自体移植物以外的来源。通过钻孔操作，骨髓干细胞在骨隧道中释放，用于形成成骨细胞。毫无疑问，其中一些细胞最终会出现在关节腔中，并可能有助于移植物的细胞结构。来自前交叉韧带（ACL）残余残端的种子成纤维细胞可在滑液中存活并产生前交叉韧带（ACL）的细胞外生化产物。同时，来自关节软骨的潜在胸膜间充质细胞可能潜在地表达非常适合在滑液中存活的成纤维细胞特性。源于滑膜的成纤维细胞样细胞（B型细胞）适于在滑液中存活，并在整个术后期间存在于关节内。这表明这些成纤维细胞最有可能成为接种自体移植物的替代细胞来源的候选者。这些细胞最初在移植物周围可见，然后迁移到基质中更松散的编织区域，在那里它们增殖并最终重新填充空缺的结缔组织基质。细胞重新填充与重建移植物中存在PDGF-AA、PDGF-BB和TGF-β1相关。证据显示，该阶段的血管和细胞来自膝关节的各种组织，如滑膜、髌下脂肪垫和假性韧带粘膜，表明在手术过程中保护这些组织确实很重要，应防止过度清创。还有证据表明，与标准前交叉韧带（ACL）相比，保留残迹的前交叉韧带重建（ACLR）在手术过程中保留了原生前交叉韧带（ACL）残端，观察到了较好的术后膝关节稳定性和临床结果。骨隧道壁的变化类似于软骨内骨化过程，骨隧道的环境类似于骨折。骨形态发生蛋白（BMP-2，BMP-7）参与骨重塑，导致骨整合。骨向内生长在移植物与骨愈合中起着重要作用，因为这一愈合阶段与改善的负荷-失效相一致。几项研究调查了改善骨向内生长成肌腱移植物的策略。骨诱导因子（BMP-2，BMP-7），骨传导剂，如磷酸钙骨水泥，和破骨细胞抑制已被研究作为改善肌腱移植物周围骨形成的潜在策略。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）在肌腱边缘表达，标志着梭形成纤维细胞从骨隧道迁移到移植物中，进而产生III型胶原。然后，总胶原含量和不可还原胶原在此过程中增加。重建韧带中的胶原纤维与原发性前交叉韧带(ACL)中的胶原纤维组织不同，具有单峰、小直径的胶原纤维直径轮廓，重塑过程从未导致原始韧带组织的精确复制。此时应该提到的是，Andreas等人的研究表明，组织学数据表明解剖干扰生物螺钉将导致直接类型的韧带插入的发展。因此，肌腱-骨结合过程可以通过使用生物螺钉固定方法得到改善。在上述整个愈合过程中，Smith等在前交叉韧带重建（ACLR）进行了前松弛试验，以观察手术当天与使用同种异体胫骨移植物第一年每个月随访间隔之间的膝关节松弛增加情况。结果表明，前松弛在6个月时增加最大，当移植物处于早期愈合期和增殖期开始之间时，这与愈合过程的时间线相关。并且在增殖后期和随后的成熟期膝关节松弛没有增加。4.前交叉韧带（ACL）移植愈合的特征是移植物植入后不同时期受局部反应影响的基质重塑过程如上所述，尽管已经尝试了生物调节的各种方式，但愈合的结果从来都不是完美的。因此，从反应的时间和位置上更好地理解和区分移植物愈合过程，可能对该领域的所有研究者都有所帮助。在此，提出了更清晰的移植物愈合图片，分为三个不同阶段（早期愈合阶段、增殖阶段和成熟阶段），随后在移植物的两个不同部位（关节内部分和骨隧道）出现不同的宿主和移植物反应：
图5：前交叉韧带（ACL）移植愈合的特征是移植物植入后不同时期受局部反应影响的基质重塑过程
在早期愈合阶段，宿主炎症和移植物细胞坏死作为前交叉韧带重建（ACLR）后移植物反应立即发生。在下一个增殖阶段，根据移植物周围的环境，在骨内（骨祖细胞）和关节腔内（成纤维细胞）招募不同类型的细胞。这些细胞通过新生血管化重新填充坏死的移植组织，以获得营养供应。随后的成熟阶段代表了在机械力和生物化学影响下，由这些重新增殖的细胞介导的基质重塑过程，这些影响随移植物表现出区域差异。骨隧道内的骨腱连接愈合和关节内部分的韧带化是受移植局部反应影响的反应性基质重塑过程。与前交叉韧带重建（ACLR）的传统移植物愈合概念相反，该研究团队强调了影响基质重塑的移植物周围环境的区域差异。生物调控应特别针对有利的细胞再增殖或有利的区域移植物周围环境，以实现基质重塑，从而恢复前交叉韧带（ACL）的原始功能。尽管已经使用了大量的生物学调节来改善上述愈合过程，但良好的前交叉韧带(ACL)移植物愈合离理想状态仍然相差很远。5.1、增强生物学调节的部位：移植物隧道界面与关节内中间物质诸如间充质干细胞、生长因子、生物材料或生物物理干预等生物调节已被用于改善愈合结果，并且这些生物策略已被长期研究试验。从不同的系统性综述中，该研究团队可以得出结论，大多数靶向移植物掺入骨隧道或腱-骨界面愈合。然而，据报道，移植物在股骨插入处最常破裂，其次是关节内中间物质。动物研究显示了相同的结果。因此，可能需要更多地关注尝试调节可能改善移植物关节内中间物质愈合结果的生物学事件。力学性能作为前交叉韧带重建（ACLR）的重要结果之一，总是在术后进行测量以与结果进行比较。然而，不幸的是，模拟天然前交叉韧带（ACL）的移植物强度从未达到。McFarland等人建立了犬前交叉韧带重建（ACLR）模型，到16周时，移植物的强度仅保持为对照组的40%。另一项研究研究了山羊术后长达3年的生物力学性能，移植物的强度和刚度分别是对照韧带的44%和49%。还对恒河猴进行了研究，肌腱的拉伸强度约为转移前的80%。对于像大鼠和兔子这样的小动物，与天然前交叉韧带（ACL）相比，它们可以达到约20%的强度。该研究团队必须清晰地认识到，实际上各种移植物的初始最终“失效强度”比植入前的天然前交叉韧带（ACL）高得多，这再次表明最薄弱的环节在骨腱连接处，这证明了研究更好的前交叉韧带（ACL）移植物愈合的努力是合理的。由于大多数的调节是在早期愈合阶段传递的，但被认为作用于增殖阶段或成熟阶段，因此需要持续传递调节，但很少有研究证明它们是否作用于所需阶段。以细胞补充为例，通过移植物中的细胞浸润和再增殖来确定增殖期。为了促进细胞的再增殖，已经输送了间充质干细胞（MSCs）、81个脂肪来源的干细胞（ADSCs）、82个前交叉韧带（ACL）来源的细胞、83个滑膜细胞和骨膜祖细胞，并研究了它们对移植物愈合的影响。转移干细胞最常用的方法是关节内和骨隧道内直接注射或包埋在纤维蛋白胶中。Mifune等人的研究表明，与直接注射或纤维蛋白胶技术相比，细胞片技术是将干细胞递送到重建前交叉韧带（ACL）中的一种更优越的策略。此外，为了实现生长因子的连续且稳定的浓度，引入了基于干细胞的基因治疗。尽管这些研究的愈合结果表明有所改善，但仍需进一步研究以精确影响靶向期。尽管外科技术有所进步，康复方案不断优化，但前交叉韧带重建（ACLR）手术后移植物的失败率仍然相对较高，其原因可能是前交叉韧带（ACL）移植物不良的愈合过程。基于对前交叉韧带（ACL）移植物愈合过程进行临床和动物研究提供的证据，已经在临床上应用了具有巨大潜能的生物学调节来促进骨-腱界面愈合。然而，所获得的机械强度仍达不到理想值，经常可以观察到连接物质破裂的病例。有研究报道了三个阶段（早期愈合阶段、增殖阶段和成熟阶段）愈合过程中更清晰的图像，在两个不同部位（关节内部分和骨隧道）出现宿主和移植物反应，旨在为更具体地在目标时间和部位传递进一步生物调节物质以增强愈合结果提供新的见解。在实验室和动物研究中，生物调节在改善前交叉韧带重建（ACLR）后移植物愈合方面具有巨大的潜力。然而，在不远的将来需要高质量的临床研究，这些研究与外科医生密切相关。外科医生还需要了解这些进展的背景，以及这些生物学调节是如何工作的，以便更好地促进未来对于前交叉韧带重建（ACLR）的研究，甚至临床实践。
