科研 | 南土所褚海燕等：盐分是决定沙漠生态系统中土壤微生物群落结构的关键因素
本文由Jingzhi Zhang编译，董小橙、江舜尧编辑。
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导 读
土壤盐碱化由于自然因素和人类活动造成的日益严重的环境问题。土壤中盐分过高，抑制植物的生长，减少物种的多样性，改变植物的群落组成；然而，人们对盐分影响土壤微生物菌落组成，知之甚少。在此，作者们描述了中国西北地区古尔班通古特沙漠土壤微生物群落沿自然盐分的梯度变化特征。微生物多样性随盐分的增加呈线性下降，群落差异随盐分差异显著增加。即便是在相同的空间距离以及其他环境变量一致的情况下，土壤盐分显著影响土壤微生物群落结构。卤代细菌，硝化破裂菌，[红热病]、γ-变形杆菌和α-变形杆菌的微生物系统发育型（n = 270）表现出对高盐分的偏好。在Bugbase预测的9个潜在表型中，氧相关表型与含盐量呈显著相关。为了探索微生物群落的进化过程，作者们使用了组内（最近 - 分类群指数[NTI]）和组内（NTI）系统发育组成之间的空模型。NTI与盐分显示出显着的负相关关系，表明微生物群落在较高盐分土壤中的系统发育较少.NTI是群落间类似物，表明确定性过程已超越所有地点的随机过程，表明微生物群落进化中的环境过滤。总之，这些结果表明了盐分对沙漠生态系统中土壤微生物群落组成和进化过程的重要性。
论文ID
原名：Salinity Is a Key Determinant for Soil Microbial Communities in a Desert Ecosystem
译名：盐分是决定沙漠生态系统中土壤微生物群落结构的关键因素
期刊：MSYSTEMS
IF：5.75
发表时间：2019年2月/3月
通信作者：褚海燕
通信作者单位：中国科学院南京土壤研究所
材料与方法
1 土壤样品的采集
采样点位于中国西北新疆古尔班通古特沙漠的东西向断面上，北纬44.21°，北纬45.51°，东经83.16°至91.77°（参见补充材料中的图S1）。该地区属温带大陆性干旱气候，年平均气温为6.4°C至7.7°C，2011至2013年平均年降雨量为102至167.4毫米（45）。2016年5月5日至13日沿着682.8公里的样带选择了24个采样点。在每个采样点，在500米×500米的样方中选择5个1米×1米的样方作为重复样本，并且在500米乘500米的样方中五块地块相距约300米。为了减少土壤非均质性的影响，我们还在1米乘1米的样方内收集了5个土样，并将它们合成，每个样方制作一个土样（图S1）。通过钻孔收集总共120个表土（0至15厘米）样品，并且所有样品在田地中储存在冰块上并立即运送到实验室。在通过2mm筛网筛分后，将每个土壤样品分成两部分，一半储存在4℃用于土壤生物地球化学性质分析，一半储存在-20℃用于DNA提取。此外，对于每个采样点，我们从中国的气象数据平台收集了2016年5月的平均气温（TEM），降雨量和增强植被指数（EVI）数据（http://data.cma.cn/site/index.html）。
2 土壤生物化学特征分析
通过使用E20-FiveEasy pH计（Mettler Toledo，Germany）测量土壤pH，并且通过使用电导率仪测定土壤电导率（土壤可溶性盐的指示剂）。在摇动30分钟后，使用土壤- 水悬浮液（去离子水- 新鲜土壤的5：1混合物）进行两种土壤测量。通过重量分析在105℃下测定土壤水分6小时。可溶性总氮（DTN）、硝酸盐（NO3-N）和铵（NH4-N）通过将5g新鲜土壤添加到50ml的2M KCl溶液中来提取，可溶性总有机碳（DOC）通过50ml去离子水提取摇动1小时并静置1小时后，通过玻璃纤维滤器（FisherG4,1.2μm孔隙空间）过滤上清液。使用连续流动分析系统（San system; Skalar，Holland）测定NO3-N，NH 4 -N和DTN的浓度。通过使用碳氮分析仪（Multi N / C 3000; Analytik Jena，Germany）测定DOC。用0.5M NaHCO3溶液提取可用的磷（P），并通过Mo-Sb比色法测量。用1M乙酸铵（NH 4OAc）萃取可用的钾（K），并通过火焰分光光度法测量。用K2Cr2O7-H2SO4氧化法测定土壤有机质（SOM），用凯氏定氮法测定总氮（TN）。
3 土壤DNA提取和16S rRNA测序
对于每个样品，根据制造商的说明，使用用于土壤的快速DNA旋转试剂盒（MP Biomedicals，Santa Ana，CA）从0.5g新鲜土壤中提取DNA。然后使用Nanodrop 1000分光光度计（Thermo Scientific，Wilmington，DE）定量DNA，并在测序前储存于-20℃。引物515F（GTGCCAGCMGCCGCGG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAGGTWTCTAAT）用于扩增细菌和古细菌中16S rRNA基因的V4高变区（46）。PCR在30μl反应中进行混合体积与15ul Phusion高保真PCR主混合物（New England Biolabs），0.2ul正向和反向引物，以及10ng模板DNA。热循环在98℃下进行1分钟，然后在98℃下进行30个循环10秒，在50℃下进行30秒，在72℃下进行30秒。在Illumina HiSeq平台（Illumina，Inc.，USA）上进行高通量测序，并产生250bp的配对末端读数。
4 数据分析
使用FLASH合并16S rRNA基因的条形码正向和反向读数（47）。基于独特的条形码为每个样本分配配对末端读数，并使用默认设置在QIIME1.9.0中进行分析（48）。使用QIIME的pick_open_reference_otus.py脚本，UCLUST将序列聚类为操作分类单位（OTU），相似性阈值为97％和Greengenes数据库（13-8版）作为参考（49）。当所有样本的计数为10时，从OTU表中消除了低丰度的OTU。QIIME的core_diversity_analyses.py脚本用于计算α和β多样性值，所有样本均稀疏至每个样本27,000个序列。
进行逐步多元回归分析以确定测量的环境变量中微生物多样性（观察到的OTU和系统发育多样性）的主要预测因子。基于距离的多元线性模型（DistLM）也用于基于Bray-Curtis距离测试环境变量与微生物群落结构之间的相关性。使用DISTLM_forward3（50）评估每个环境变量的贡献。还进行了多变量回归树（MRT）分析，以检测微生物群落结构与所有测量的环境变量之间的关系（51）。使用“lse”方法的总共1,000个交叉验证被用于降低树的复杂性以识别微生物群落结构的主要预测因子。使用m中的mvpart包进行MRT分析。通过更精确的方法，QIIME2中的片麻岩检测微生物系统型的分化（52）。该方法使用平衡树的概念来推断微生物子社区的变化，以评估生态位分化而不是基于比例的个体物种的变化。将梯度聚类应用于组微生物到它们的优选栖息地，使用ilr-转换来计算组之间的等长对数比，并且使用普通最小二乘分析来计算微生物群落概况的平衡。在片麻岩分析中过滤具有少于120个读数的OTU以避免聚类错误。BugBase是一种生物级预测算法，可用于预测生物学上可解释的表型特征，如革兰氏状态，氧需求和生物膜形成（53）。在该研究中，使用BugBase的Web应用程序版本（http://bugbase.cs.umn.edu）来获得基于16S rRNA基因序列的表型信息。
最近的分类群指数（NTI）用于评估群落内的系统发育群落组成，高或正值表示整个系统发育中的分类群聚类，而低值或负值表示跨系统发育的分类群过度分散（41）。NTI的值相当于MNTD的标准化效应大小的1倍（平均最近- 分类距离），并且通过将观察到的系统发育相关性与“taxa.lables”null模型下的预期模式进行比较来计算MNTD的标准化效应大小。“picante”R包中的999个随机化。计算丰度加权的βMNTD以使用Phylocom软件推断社区之间的社区系统发育周转（54）。接下来，通过计算α最近分类群指数（βNTI）来应用社区间零模拟方法来推断社区组装过程.βNTI表示观察到的βMNTD与预期MNTD之间的偏差。如预期的βMNTD代表随机过程的主导地位，βNTI的值可用于推断随机过程和确定性过程的主导地位。落入零分布（-2<βNTI <2）的NTI成对比较表明随机过程的优势，而NTI大于2或小于2的成对比较的比例表明确定性过程的优势（55）。采用部分曼特尔检验和皮尔逊相关法，估算了微生物群落差异性（布雷-柯蒂斯距离）和一个解释矩阵(如土壤盐分距离基于欧几里得距离,空间距离,或环境的距离,除了盐分基于欧氏距离)在控制了其他两个矩阵。
与该研究相关的所有测序数据已经以项目登录号SRP112798保藏在NCBI序列读取档案（SRA）中。
补充材料:https://doi.org/10.1128/
实验内容
在120个土壤样品中获得总共4,244,827个16SrRNA V4区域基因序列。根据测序数据，15,147个操作分类单位（OTU）以97％的身份注释。优势微生物门包括放线菌（~41.32％），变形菌门（~24.21％），拟杆菌（~5.08％），绿弯菌门（~5.38％）和厚壁菌门（~6.28％），占总序列的80％以上（见图2,补充材料中的S2）。
我们首先探讨了微生物α多样性（观察到的OTU和Faith的系统发育多样性）与15个环境变量之间的关系（表S1）。使用逐步多元回归模型分析，我们发现盐分始终是观察到的OTU和系统发育多样性的最佳预测因子，分别解释了观察到的OTU数量和Faith系统发育多样性变异的22.5％和18.2％（表1）。此外，盐分与观察到的OTU和Faith的系统发育多样性具有强烈的负线性关系（图1）。
图 1
基于距离的多元线性模型（DistLM）分析表明，盐分是决定微生物群落结构的最重要因素，并且解释微生物群落结构总变异的9.35％（表S2）。此外，多元回归树（MRT）分析用于探讨环境变量对微生物群落结构的影响。尽管所有15个测量的环境变量都包含在分析中，但只有盐分分割树并将样本分成三个盐分梯度（图S3）。微生物Bray-Curtis相异性也显示出与土壤盐分差异显着负相关（R2= 0.336; P <0.001）（图2），这表明两个地点之间的盐分差异越大，微生物群落结构之间的差异越大。由于地理距离也是引起微生物群落结构变化的重要因素，因此在控制空间距离和其他环境距离（不包括盐分）之后，使用部分Mantel检验来估计盐分距离对微生物群落结构的影响。尽管盐分和地理距离对微生物群落结构都有显着影响，但盐分的影响强于地理距离（表2）。总之，这些观察结果强烈表明，盐分是塑造沙漠土壤微生物群落结构和多样性的关键因素。
图 2
盐分被发现是微生物多样性和群落组成的主要驱动因素，这促使我们在更精细的分类水平（如系统类型）研究盐分对土壤微生物的影响。平衡树方法显示微生物OTU在盐分梯度上有明确的生态位分化（图3a和b）。高盐分OTU（535～4601us/cm）逐渐增多。
随着盐分的增加，被低盐分的OTU（46.2～535 us/cm）所取代，形成树顶平衡的线性趋势（图3c）。为了从树的顶端平衡中提取分类信息，在高盐分的地方发现了270个属于卤代细菌、硝化破裂菌、[rhodothermi]、γ-变形菌和α-变形菌的分类群，而3136个属于α-变形菌、放线菌、嗜热菌、杆菌和嗜酸菌的分类群则被认为是最丰富的。低矿化度地区丰富的矿石（图3d）。利用BugBase，我们预测了9个潜在的表型，包括好氧、厌氧、含移动元素、兼性厌氧、生物膜形成、革兰氏阴性、革兰氏阳性、潜在致病性和耐应激性。在所有表型中，厌氧表型相对丰度与盐分呈显著正相关，耐应激表型相对丰度与盐分呈极显著正相关（P< 0.1）,而兼性厌氧和生物膜形成表型的相对丰度与盐分呈显著负相关（图4）。
图3
图4
此外，为了弄清盐分如何影响微生物群落组装过程，我们使用了群落内（最近的分类群指数[NTI]）和群落（βNTI）零模型。我们发现NTI与盐分之间存在显着的负相关关系（图5A），表明盐分的增加降低了微生物群落中系统发育聚类的程度。尽管βNTI与盐分差异之间没有显着关系，但几乎所有的βNTI值都低于-2，这意味着环境因素在微生物群落中起主导作用。
图5
讨 论
本研究的第一个目标是探索盐分对沙漠生态系统中微生物群落多样性和群落结构的影响。在这项研究中，我们使用扩增子测序来研究盐分对微生物群落的影响，发现观察到的OTU和Faith的系统发育多样性与盐分有显着的负相关（图1）。这种负面影响的可能解释可归因于土壤中盐的积累提高了细胞外渗透压（5,28），并且许多不能适应渗透胁迫的微生物可能死亡或变得不活跃，从而减少微生物α多样性。土壤微生物群落结构的变化也主要通过本研究中的盐分来解释，这与河口和海洋环境中的结果一致（29-31）。然而，一项研究盐分为34.2mS / cm至123mS / cm的高盐分湖泊附近的土壤和沉积物微生物群落的研究发现，微生物群落的变化与场地含水量，营养物浓度和pH值高度相关，而非盐分（12）。在之前的研究中报告的对比结果可能是由于在已经富含盐的环境中进行了局部采样。
本研究报告的盐分梯度上微生物群落组成的变化（图2）对物种分类具有一定意义，耐盐物种越多，耐盐物种越少。那些在高盐分环境中生长的微生物通常采用两种策略来平衡细胞质的渗透潜能（28）。一种是“盐入”策略，它包括吸收离子，例如主要是钾离子。这一策略经常被一些嗜盐菌使用，如盐杆菌科、盐杆菌和发酵性清真酵母。因此，在高盐分土壤中发现更多的盐细菌是合理的（图3d）。盐杆菌科在盐渍土（32）、湖泊沉积物（33）和海洋环境（34）中普遍存在。另一种策略是“低盐入”策略，该策略包括在细胞内积累低分子量有机化合物（例如氨基酸和碳水化合物），以将盐从细胞中排除（35）。以前的独立于培养的研究发现了与细菌门、变形杆菌、放线菌、拟杆菌和双子体相关的显性嗜盐和耐盐分类群（36，37）。本研究所发现的属于变形杆菌、拟杆菌、放线菌和卤代菌的微生物类群具有高盐分生态位偏好（图3），这些类群可能是高盐分耐受群落的潜在生物标志物。此外，为了揭示功能性状对盐分增加的反应，Bugbase被用来预测潜在的表型。氧相关表型与盐分有显著关系（图4）。高盐分已被证明会引起土壤颗粒的分散（38）；因此，这些与氧相关的表型发生变化是合理的，因为土壤颗粒的分散（39）可能会影响氧的可用性。
盐分不是沙漠中微生物的唯一压力，通常与低水资源利用率和高ph（5）结合在一起。在本研究中，土壤水分是影响群落多样性和结构的第二个重要因素（表1；另见补充材料中的表S2）。微生物细胞含有近70%的水分，土壤含水量是决定微生物群落的重要因素，因为它对土壤中微生物资源的气态和液态扩散有很强的控制作用（40）。将盐分和干燥再湿过程结合在一起的短期微观实验发现，盐分含量（9）的积累加剧了降低水分对细菌生长和呼吸的抑制，表明对微生物群落的影响比仅高盐分更为严重。
本研究中高盐分地点的微生物多样性极低，表明栖息地过滤，这得到所有正NTI值的支持（图5A）。NTI阳性值表明，群落在系统发育上的聚集程度超过了偶然预期（41），反映了微生物群落的环境选择压力，形成了一个非随机的社区库（42）。尽管盐分对微生物群落具有强烈的选择压力，但应该注意到NTI随着盐分的增加而降低，这意味着微生物群落组装在更多盐水土壤中的系统发育较少。了解盐分是微生物群落的主要决定因素，并且只有很好地适应高盐浓度的分类群才能在高盐环境中占优势（28），当环境适合于环境时，预计系统发育聚类的强度会增加微生物的一个子集（43）。在先前的研究中，发现土壤细菌系统发育聚集的程度在更酸性和更碱性的土壤中更大（25）。在这项研究中获得的对比结果可以用两种方式解释。首先，虽然微生物生活在高盐环境中，但这并不一定意味着只有密切相关的分类群才能在这种特殊的环境中共存。例如，之前的一篇综述探讨了超高温系统中古菌的多样性，发现这个高盐分栖息地拥有一个具有不同代谢途径的系统发育不同的古菌群（44）。其次，由于植物生长稀疏（5），高盐分地区的资源有限可能导致一些密切相关的分类群的竞争性排斥，这是过度分散的系统发育的信号（42）。在这项研究中，盐分对微生物群落结构和组装的强烈影响可以通过确定性过程的较高相对重要性来解释，并且βNTI测试了确定性过程的主要作用（图5B）。
总之，我们通过对自然土壤盐分梯度的沙漠生态系统中的16S rRNA基因进行测序来描述土壤微生物群落。我们的研究结果为盐分对微生物群落组成和组装的影响提供了有力证据，这将有助于揭示沙漠生态系统如何对正在进行的盐渍化作出反应。为了推进我们对这些严重盐化条件下生态系统动态的理解，未来应该努力建立广泛的数据集，用于探索微生物对盐分响应的规律。
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