科研 | MOVEMENT DISORD：揭开帕金森病和非典型帕金森综合征的肠道微生物群的神秘面纱
本文由团儿编译，玛莉、江舜尧编辑。
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近年来，人们越来越关注PD起源于肠道并通过不同的病理生理途径传播到大脑的假说（例如，神经元α-突触核蛋白传递或增加有毒物质的渗透性或肠道免疫反应相关的全身性炎症）。一些观察研究支持这一假说，如α-突触核蛋白染色在肠神经系统中增加，α-突触核蛋白经由迷走神经轴突向脑干的逆行运输，迷走神经干切断术（非超选择性的）的保护作用，运动症状发病前几年发生便秘，肠道生态失调伴随着高粘膜通透性。尽管如此，关于肠神经系统中α-突触核蛋白染色特异性的结果存在着公开的争论，因为也有一个离心转运的证据。
虽然最近发表了一些关于肠道菌群组成（微生物）潜在作用的研究，由于研究结果的异质性（附表1），现有的证据仍然有限。对这种不一致性的可能解释是一些研究的样本量小，以及缺乏对潜在混杂因素的控制，即肠道微生物群的塑造，如饮食习惯。通常会在具有多变病程的PD患者药物治疗过程中检测肠道菌群，可以联想到疾病进展和药理学治疗能够影响肠道菌群的组成。通过对新发PD患者病例-对照研究的分析，可以推断出一个更强的因果关系。最后，由于tau蛋白的病理学尚未被探索，这一猜想都集中在菌群和帕金森氏症的联系，假定肠道菌群对α-突触核蛋白在肠道神经系统中的聚集的效应。
我们旨在评估PD群体与健康对照的肠道微生物群特征的差异，大量的数据集合包括新发患者，未经药物治疗的患者以及原发性非典型帕金森综合症，如突触核蛋白病多系统萎缩（MSA）和tau蛋白病进行性核上性麻痹（PSP）。我们还关注肠道微生物群与疾病严重程度之间的关联以及PD的临床特征，控制多个混杂因素的分类学结果。
论文ID
原名：Unraveling gut microbiota in Parkinson's disease and atypical parkinsonism.
译名：揭示帕金森病和非典型帕金森综合症的肠道微生物群
期刊：Movement Disorders
IF：8.324
发表时间：2019年
通信作者：Emanuele Cereda
通信作者单位：意大利圣马特奥IRCCS基金会医院
实验设计
我们在意大利米兰帕金森研究所的三级保健门诊部设计了一个前瞻性病例对照观察研究（2014年7月1日至2017年2月28日）。研究分析了包含350名个体的大型队列。我们根据英国脑库诊断标准招募了特发性PD患者（n=193），包括一组未经治疗的新发患者（n=39）（粪便标本采集后至少有2年的随访，以确认PD的诊断。PD患者根据疾病持续时间分为早期PD（持续时间≤5年），中期PD（6-10年）和晚期PD（≥11年）。我们的队列还纳入根据既定标准诊断出患有PSP（n = 22）和MSA（n = 22）的患者。
将患者与一组按年龄，营养状况（体重指数）和地理区域（意大利居住地区）进行匹配的对照参与者（n = 113）进行比较，并选择患者的配偶纳入人群陪伴患者入组作为社区健康对照，或出于其他轻微健康原因（即轻微的皮肤病，神经疾病，眼科或骨科疾病）就诊于同一医院的患者作为医院对照。
病例和健康对照的排除标准是正在进行的人工营养; 慢性炎症性肠病; 任何类型的自身免疫疾病; 急性炎症性疾病（如病毒/细菌感染）; 大的胃肠道手术史; 过去一个月内使用抗生素，益生菌，皮质类固醇或其他免疫抑制药物; 放化疗; 有严重的认知缺陷妨碍评估的执行; 和疾病的晚期治疗（深部脑刺激，连续阿扑吗啡或左旋多巴十二指肠输注）。对所有案例都进行头部的磁共振成像检查。
临床评估
记录一般人口统计学信息（包括分娩类型[剖宫产与自然]）和临床数据。使用统一帕金森病评定量表（UPDRS）和Hoehn和Yahr分级进行临床评估。使用简易精神状态检查评估认知功能，使用非运动症状问卷评估非运动症状的严重程度。根据罗马-III标准评估便秘的存在。相关的临床特征根据临床诊断标准，当前的药物治疗，以及完整的UPDRS（附表2）定义。计算分数能够区别出多巴胺能和非多巴胺能运动症状。以左旋多巴等效日剂量计算药物治疗。PD发病年龄小于50岁的患者用于筛选最常见的隐性致病基因突变(Parkin, DJ1, Pink1)。
营养评估
由训练有素的营养师根据世界卫生组织的指导测量体重和身高，并相应地得出体重指数（kg/m2）。用10天的定量食物日记调查饮食习惯，所有参与者回忆每天24小时的饮食，并通过了经过验证的食品部分图谱进行确认。使用WinFood软件分析记录的数据（https://www.winfood.it/）— 其中包含天然和商业食品的完整和更新的组成表 — 计算卡路里，蛋白质（和相关来源[动物/植物]），纤维（和相关类型[不溶/可溶]），水（mL）的每日摄入量）和酒精（克）。还记录了有关泌乳方式（配方奶或母乳喂养）的信息。
粪便采样，处理和测序
收集每个参与者的粪便放入无菌粪便容器中并立即储存在-20℃。不添加防腐剂。使用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒的改进操作方案在1个月内提取来自粪便物质的总细菌DNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度计和安捷伦科技TapeStation 2200仪器测定每个样品的DNA浓度和质量。16S核糖体RNA（rRNA）基因的V3-V4区域在Illumina MiSeq平台上进行多次扩增和测序，使用2×250bp配对末端方案将350个样品根据操作说明混合在一起。
微生物数据分析
使用Pandaseq分析原始读数，通过QIIME线路（版本1.8.0）进行处理，聚集到97％标识级别，并通过核糖体数据库项目（RDP）分类器对Greengenes数据库进行分类学分配（版本13.8）; http://greengenes.secondgenome.com）。使用Chao1和Faith的系统发育多样性（PD_whole_tree）度量来计算α多样性估计。至于β多样性，主要坐标分析是在加权和未加权的UniFrac距离的基础上进行的。如前所述采用Kendall的相关性进行共丰度网络分析，并通过Spearman的相关度量和Ward连接在物种级别建立共丰度组的分层聚类。Cytoscape（3.0版）用于进行共丰度组的聚类以及细菌属的相对丰度和相关强度数据可视化图形显示。最后，通过重建未观测到的状态来研究群落的系统发育，KEGG数据库用于对新发PD患者和对照中的细菌代谢途径进行功能预测。有关微生物群数据分析的详细信息，请参阅补充材料。
实验结果
PD，MSA和PSP患者的微生物组成
α-多样性分析显示，PD患者的特征是丰富度高于HC（P = .012），而MSA和PSP则没有。稀释曲线显示在补充图1A，B中。
β-多样性分析同时使用未加权和加权UniFrac表明PD，MSA，和PSP在群落的系统发育上距离遥远，虽然MSA和PSP表现出相似的分布，不同于HC和PD的比较（图1A）。仅HC与MSA和HC与PD的比较是显着的（P值分别为0 .045和0.002）。
表1 研究人群及相关亚组的一般特征
PD与健康对照（HC）的比较
PD患者与HC未校正的比较显示相对分类群丰度存在若干差异，这一点通过共丰度网络分析得到了一致的反映（图2；补充结果）。然而，在校正多个混杂因素后，显著差异的数量大大减少（附表3）。尤其是在门的水平上，疣微菌门在PD中比在HC中高出两倍以上，并且同样适用于疣微菌科和阿克曼属。我们还观察到变形菌，肠杆菌科，克里斯滕森菌科，乳酸杆菌科，红蝽杆菌科，双歧杆菌科，副杆菌属（及相关属）的增加，以及毛螺菌科的减少，特别是罗斯氏菌属。瘤胃菌科没有差异，尽管在其瘤胃球菌型和颤螺菌属中分别观察到显着的减少和增加。
关于混杂因素，我们观察到年龄对几乎所有丰度的持续影响以及一些其他因素（例如，性别，便秘和咖啡消费）的异质和稀疏影响。儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂的使用影响了几个类群的水平：厚壁菌门（↓），毛螺菌科和瘤胃菌科（↓），放线菌（↑），紫单孢菌科（↑），乳酸杆菌科（↑）和变形菌（↑）。质子泵抑制剂的使用与一些细菌家族的丰度增加有关，特别是克里斯滕森菌科和乳酸杆菌科。除了纤维摄入对乳酸杆菌科的影响（↑），我们还强调了配方奶喂养对厚壁菌门（↓），克里斯滕森菌科（↑）和毛螺菌科（↓）的影响。
图1加权UniFrac距离的主坐标分析，代表患者组（A）和疾病持续时间阶段（B）之间的差异。每个点代表一个样本，质心代表其平均值，椭圆代表基于平均标准误差（SEM）的数据置信度。统计学上显着的P值：（A）HC与PD（P = 0.002），HC与MSA（P = 0.045）; （B）HC与早期（P =0 .039），HC与中期（P =0 .013），HC与晚期（P =0 .01）。由第二和第三主成分占据的百分比方差沿两个图的轴显示。HC，健康对照; PCoA，主坐标分析。
MSA，PSP与健康对照的比较
在两项未校正的比较（对于聚类分析[共丰度组的聚类];参见图2）和校正后的模型中，MSA和PSP患者显示出与PD相似的变化（附表3），但有一些值得注意的例外。毛螺菌科及其罗斯氏菌属在MSA中的含量没有显着低于HC，而瘤胃菌科的分布和普雷沃氏菌科的丰度分别呈现显着不同和降低。在PSP中，我们观察到链球菌科的水平低于HC，与HC相比，乳酸杆菌的丰度没有差异。
不同疾病持续时间的PD患者微生物组成
虽然跨疾病阶段的α-多样性分析显示没有显着差异（附图1C，D），但系统发育分析显示疾病持续时间群落在β-多样性方面具有差异，随着疾病持续时间的增加，患者与HC之间的距离增加（图1B）。
至于分类学特征，当与HC相比且不同于药物治疗的PD患者，新发PD的特征在于毛螺菌科的丰度较低（P =0 .049），特别是其罗斯氏菌属属于和未分类的分类群（附表4）。
PD组中描述的许多差异与疾病持续时间一致。然而，在这组分析中调整多个混杂因素后，许多差异也不再显着。有趣的是，在几乎所有PD持续时间段中，毛螺菌科（及其罗斯氏菌属）的水平降低仍然显着。我们发现，随着乳酸杆菌科（和乳酸杆菌属）和阿克曼属（以及疣微菌门和疣微菌科）的增加水平和毛螺菌科的丰度减少，疾病持续时间的显着趋势效应。
微生物群和PD的临床特征
在第二级分析中，发现PD患者和对照之间差异显著的分类是PD队列中疾病严重性和临床表型的潜在调节剂。在具有克里斯滕森菌科较高丰度的患者中观察到更糟的非运动症状。乳酸杆菌科和毛螺菌科以及相关属（乳酸杆菌和未分类的毛螺菌）水平增加与智力障碍，更严重的运动症状（UPDRS第III部分评分）和非多巴胺能特征相关，包括轴突损伤的症状，如步态紊乱和姿势不稳定性（详见表2和附图3）。
图2 描述肠道微生物群中细菌属的共丰度网络图：（A）健康对照，（B）PD，（C）PSP，（D）MSA。绘制在至少1组中至少30％的样品中具有至少0.5％相对丰度的细菌属。节点大小代表疾病组或健康对照中的相对丰度。节点之间连接线的粗细表示相关性（也参见附图2）。
微生物功能概况分析（新发PD患者与HC）
功能预测分析显示，与HC相比，所测试的329种细菌代谢途径中的26种在新发PD患者中被改变（上调，n = 11;下调，n = 15）（附表5）。根据KEGG的1级分类，不同的途径涉及细胞过程，环境和遗传信息处理，人类疾病和新陈代谢。在2级分类中，与代谢相关的途径涉及氨基酸，能量，聚糖，脂质，辅因子和维生素以及生物异源物质。
讨论
我们通过应用稳健的统计方法，调整潜在的混杂因素，研究了大量帕金森病和HC患者肠道微生物群的变化。虽然我们的结果证实，与HC相比，PD的特征是微生物群组成的几个变化，但他们强调这种分析受到几种混杂因素的极大影响，包括疾病严重程度本身。我们对新生患者的关注支持PD和肠道微生物群之间病理生理学联系的假设，特别是毛螺菌科的丰度减少。第二，根据PD临床特征的组内分析表明，微生物组合物（特别是毛螺菌科和乳酸杆菌科）在运动和非运动症状严重程度的个体间异质性中的潜在作用值得进一步研究。最后，我们在MSA中也显示了微生物组成的重要变化，并且首次在PSP患者中研究微生物组成的变化。
表2 PD患者的临床特征与相关类群丰度之间存在显著的相关性
PD患者的肠道微生物群
与先前的研究一致（附表1），我们观察到属于厚壁菌门的分类群减少，如毛螺菌科和其它属（罗斯氏菌属），以及疣微菌门增加，变形菌，克里斯滕森菌科，放线菌相关科和乳酸杆菌科。尽管如此，其他作者观察到相反的结果，例如乳酸杆菌的减少且有瘤胃菌科的增加。已经提出了许多因素来解释这种异质性，包括地理背景，一些研究的小样本量以及缺乏对多种混杂因素的控制。然而，在本研究之前，只有少数研究已经解决了这个问题，显示微生物组成的类似差异，包括普雷沃氏菌属中没有变化，这些发现已被首次提出作为潜在的保护因子。最后一次观察通过控制饮食证明其是主要菌群的主要决定因素。病程本身似乎是一个重要的混杂因素，一些前人研究中PD持续时间介于6到14年使得评估产生偏倚。因此，我们不能排除微生物组成的某些变化是代偿性的。其他的研究结果已经报道了不同的病情特点是大量的局部炎症，这表明它也可以作为一个可能的结果，而不是疾病的原因。
从病理生理学的角度来看，在没有前瞻性研究的情况下，新发患者和HC之间的比较显然是最相关的。有趣的是，这两组之间的差异仅限于毛螺菌科及相关属的丰度较低。毛螺菌科参与短链脂肪酸（丁酸盐，丙酸盐和乙酸盐）的产生，短链脂肪酸是肠上皮细胞的重要能量来源，因此有助于维持局部上皮屏障的完整性和免疫激活。我们的研究结果与最近关于早期左旋多巴初治患者的研究相反，报道了与HC相比，疣微菌科（阿克曼属）未分类的细菌和未分类的厚壁菌增加了，普雷沃氏菌科有所减少。不一致性可以通过不同的设计（对照组样本量少[n = 28]，仅纳入经其他抗PD药物治疗的男性患者，并且缺乏对多种混杂因素的控制）和微生物分析的方法学方法来解释。
肠道微生物群和PD的临床特征
按照先前的观察，我们发现分类学与临床特征显著相关，特别是与非运动症状（如认知障碍），非多巴胺能运动症状（如步态障碍和姿势不稳定）和疾病的严重程度（即Hoehn和Yahr分级）。在控制多个混杂因素之后，发现最重要的相关性是乳酸杆菌科（↑）和毛螺菌科（↓）的丰度，其方向与HC和整个PD群体之间观察到的差异一致。值得注意的是，乳酸杆菌可能通过迷走神经传入对肠神经系统的活性及其α-突触核蛋白的分泌以及脑化学产生影响。在我们的研究中，运动和非运动症状与减少的毛螺菌科有关。在肠杆菌科细菌丰度较高的患者中观察到更严重的PD表型。与这些研究一致，总UPDRS评分与推定的病原体（例如肠球菌和埃希氏菌属 - 志贺氏菌）的丰度之间存在正相关- 这可能会减少短链脂肪酸的产生并产生更多的内毒素和神经毒素 - 并且与假定纤维素降解菌存在负相关（如相关粪杆菌属和瘤胃球菌属）。林和同事发现了在具有非特征性显性表型的患者中，罗斯氏菌（毛螺菌科）具有更显著的丰度。另一方面，其他人未发现早期左旋多巴初治PD患者与临床特征有任何显着的分类学关联，是因为样本量小且疾病持续时间短。到目前为止，只有一项前瞻性研究可用，并且尽管有其局限性（在本研究中，与病情恶化组相比，稳定组的左旋多巴当量日剂量在随访期间明显增加），表明微生物组成和运动症状无关，并检测到UPDRS-1（即认知/神经精神症状）的变化与双歧杆菌和脆弱拟杆菌组的计数之间的反比关系。总而言之，这些观察结果支持假定的促炎细菌和保护性细菌群落之间的不平衡的负面影响，所述细菌群落产生短链脂肪酸也对疾病严重性起作用，其中毛螺菌科具有主要作用。如前所述，我们观察到新发PD患者的显着差异仅限于毛螺菌科，趋势分析显示乳酸杆菌科和疣微菌门的差异主要由疾病持续时间来解释。考虑到先前的文献与乳酸杆菌科的有益效果一致，我们也不能排除这后两种微生物群体的代偿性变化。
MSA和PSP患者的肠道微生物群
调整多个混杂因素后，非典型帕金森综合征（MSA和PSP）患者中发现了几个微生物群落的显着变化。这两种疾病的生理障碍与PD中报道的变化有相似之处。然而，分类学数据不易解释，因为不能排除与小样本量相关的偏差。迄今为止，在MSA患者中只进行了较小的试验研究（n = 6），报道属于拟杆菌和变形菌门的各种类群中革兰氏阴性菌的丰度较高，以及来自毛螺菌科的抗炎菌和瘤胃球菌科的丰度较低。与我们研究唯一的相似之处为粪杆菌属的丰度降低。
我们在PSP患者中的发现是首次的。有趣的是，主张不同的微生物群落在不同疾病的病理生理参与，并考虑对中的潜在作用之前的观察乳酸杆菌在肠道α-突触核蛋白代谢，我们注意到分别增加和MSA和PSP患者乳酸杆菌的水平相当。另一方面，考虑到PD患者的分析以及疾病持续时间/严重程度对乳酸杆菌科的重要作用，我们不能排除其他类型的帕金森病综合征的一些甚至所有观察到的差异是结果，而不是疾病的原因。
预测功能分析
为了研究肠道微生物群在PD发病机制中的作用，我们决定进行功能预测分析。这仅限于新发病例，以避免与疾病持续时间相关的潜在混淆。考虑到PD组作为一个整体，与HC相比，预计会改变许多代谢途径，其意义难以揭示。尽管如此，一些研究结果值得一提，以促进未来的研究。首先，我们发现泛素系统内的过程增加，这可能影响肠壁内α-突触核蛋白聚集体的形成。其次，我们在PD中发现的生物异源物质降解途径的上调与先前的研究一致，并且可能有助于解释接触杀虫剂和溶剂的患者PD风险增加。
优点和局限
首先，考虑到先前PD中微生物群的异质性个体研究结果，我们强调了控制多种混杂因素的重要性，特别是疾病持续时间和饮食因素。其次，我们重点关注新发PD患者。虽然这种分析并不是首次发表，但我们经过充分的后续跟踪以消除潜在的偏倚来源。第三，我们有相对较大的MSA队列和首次报道PSP的数据，提供了有关微生物群的补充信息。在这些局限性中，我们认识到缺乏乙状结肠黏膜活检（我们选择不纳入这些样本，以提供关于大量患者和足够规模的匹配对照参与者的数据），通过整个宏基因组分析和代谢物检测，我们缺乏对微生物功能的表征分析以及病例对照的研究设计，这使我们无法调查真正的因果关系。我们不能排除与潜在回忆偏倚相关的残余混杂（如哺乳或分娩的类型）和由于使用频率低而未考虑的药物 - 微生物群相互作用以及避免模型的过度调整。然而，配方喂养和剖腹产在7年前并不常见，我们可以得到更可靠的报告。此外，我们没有考虑肠易激综合征的存在，这在该人群中可能更为普遍，其作用值得进一步研究。
结论与展望
目前的结果支持肠道微生物群在PD的病理生理学中的潜在作用，并且还表明了其对疾病严重程度的潜在影响; 此外，它们进一步证实调查结果不具有普遍性。实际上，未来的研究必须考虑所有潜在的混杂因素，并关注早期PD病例以及MSA和PSP的早期阶段。毛螺菌科的致病作用和乳酸杆菌科在疾病严重程度和进展中的真正参与需要进一步阐明。有必要进行高质量的前瞻性调查，以解决特定分类群的生物学意义。尽管如此，在更复杂的情况下，有理由认为早期或甚至前驱PD阶段的干预研究将使研究人员解开肠道微生物群的潜在疾病改善作用。
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