科研 | Microbiome：微生物组的定义重新审视:旧概念和新挑战
编译：gu作成熟，编辑：小菌菌、江舜尧。
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微生物组研究领域在过去的几十年中发展迅速，已成为具有重大科学和公共利益的话题。由于对不同领域兴趣的迅速增长，我们缺乏对“微生物群”一词明确的、普遍同意的定义。此外，对微生物组研究的最佳实践也缺乏共识。最近，一个由国际专家组成的小组讨论了目前欧洲资助的微生物群落支持项目框架中存在的差距。来自不同微生物领域的大约40名领导人参加了这次会议，同时来自世界各地的100多名专家参加了随研讨会一起进行的在线调查。这篇文章摘录了研讨会的成果和相应的在线调查，嵌入了一个简短的历史介绍和未来展望。我们根据1988年Whipps等人提供的紧凑、清晰和全面的描述，提出了微生物组的定义，并根据最新的技术发展和研究成果，对其进行了一系列新颖的建议我们明确区分了微生物群和微生物群两个术语，并就微生物群的组成、微生物群在时间和空间上的异质性和动态性、微生物网络的稳定性和恢复力、核心微生物群的定义进行了全面的讨论，以及功能相关的关键物种以及微生物宿主和微生物群落内物种间相互作用的共同进化原理。这些宽泛的定义和建议的统一概念将有助于在未来提高微生物组研究的标准化，并可能成为对数据进行综合评估的起点，从而使基础科学知识更迅速地转化为实践。此外，微生物组标准对于解决与地球健康领域人为驱动的变化相关的新挑战非常重要，对微生物组的理解可能在其中发挥关键作用。
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主要内容
1 从微生物到微生物群:历史概述
图1.微生物组研究的历史从70世纪到我们的时代，突出了范式的转变，从微生物作为非社会的有机体引起疾病，到整体的观点，微生物是一个健康概念的中心:积极地连接我们生活的所有领域。
2 定义微生物组—当前的定义和差距
细微生物群落通常被定义为生活在一起的微生物的集合。更具体地说，微生物群落被定义为多物种组合，其中(微生物)有机体在一个连续的环境中相互作用。在 1988年，威普斯和他研究根际微生物生态学的同事首次给出了微生物组这个术语的定义。他们将“微生物组”描述为“微生物”和“生物组”两个词的组合，将“特征明确的微生物群落”命名为“具有明确的生理化学特性的，具有独特理化特性的栖息地”，作为其“活动场所”（表格1）。这一定义代表了微生物群落定义的实质性进展，因为它定义了具有独特特性和功能的微生物群落及其与环境的相互作用，导致特定生态位的形成。然而，在过去的几十年里，已经有许多其他的微生物组定义被发表。描述在生态环境中的微生物群落，指在身体空间或其他环境中的共生、共生和致病微生物的群落。这些定义意味着宏观生态学的一般概念可以很容易地应用于微生物与微生物以及微生物与宿主的相互作用。然而，这些从宏观真核生物发展而来的概念，在多大程度上适用于休眠、表型变异和水平基因转移等生活方式不同的原核生物以及微真核生物，尚不十分清楚。这提出了一个全新的微生物群落生态学概念模型和理论的挑战，特别是在微生物相互作用的不同层次和宿主生物和非生物环境。许多当前的定义未能捕捉到这种复杂性，并将术语微生物组描述为只包含微生物的基因组(表1)。修订后的概念框架将允许我们从分类微生物转向对微生物的功能及其与环境的相互作用的更全面的观点。然而，这将需要在不同领域工作的科学家之间进行更多跨学科的互动。微生物组的各种观点是微生物支持研讨会讨论的中心部分。研讨会的参与者讨论了一些关键点，并提出了澄清和修改最初Whipps和同事定义的建议。这些修正案地址(1)微生物组的成员,(2)微生物组的成员之间的交互和在现有微生物网络,(3)时空特征的微生物环境,(4)核心微生物群,(5)从功能预测物种的表型,(6)microbiome-host或环境互动和共同进化。
表1 微生物的定义。
3 微生物组的成员
微生物群包括形成微生物组的所有活的成员。表2解释了两个词的词源和差异。细菌、古菌、真菌、藻类和小型原生生物应被视为微生物组的成员;大多数微生物研究人员都同意这一定义。噬菌体、病毒、质粒和可移动遗传元件的整合是微生物组定义中最具争议的观点之一。在“微生物组定义”在线调查中，参与者的评论也证实了这一点。对于病毒和噬菌体是否应该成为微生物的一部分这个问题，调查参与者的回答没有给出明确的答案，从“无论如何”到“绝对不”。关于从死细胞中提取的细胞外DNA(所谓的“遗迹DNA”)是否属于微生物组，也没有明确的共识。遗迹DNA可占土壤中已测序DNA的40%，在更广泛的栖息地分析中，遗迹DNA平均可占细菌总DNA的33%，在一些样本中最高比例为80%。有趣的是，尽管遗迹DNA无所不在且数量众多，但它对分类和系统发育多样性的估计影响极小。当涉及到具体术语的使用时，明确区分微生物组和微生物群有助于避免有关微生物组成员的争议(图2)。微生物群通常被定义为存在于特定环境中的活的微生物的集合。噬菌体、病毒、质粒、朊病毒、类病毒和游离DNA通常不被认为是活微生物，它们不属于微生物群。微生物组这个术语，因为它最初是由Whipps和他的同事，不仅包括微生物群落，还包括他们的“活动剧场”。因此，所有可移动遗传元素，如噬菌体、病毒和
表2 微生物/微生物群词源
图2 强调微生物组这个术语的组成的示意图，包含微生物群(微生物群落)和它们的“活动场所”(结构元素、代谢物/信号分子和周围环境条件)。
4 微生物网络与相互作用
微生物之间相互作用，这些共生的相互作用对微生物的适应性、种群动态和微生物群系内的功能能力有不同的影响。这些网内的交互模式可能是积极的(互惠、协同或共栖)，消极的(顺栖[包括捕食、寄生、拮抗或竞争])，或中性的，即对交互物种的功能能力或适应度没有(或未观察到)影响(图3a)。复杂微生物生态系统的稳定性取决于同一底物在不同浓度下的营养相互作用。次生代谢物在介导复杂的物种间相互作用和确保在竞争环境中生存方面发挥着重要作用。种间直接电子转移(饮食)是大多数厌氧生态系统中一个重要的通讯机制。：此外，所谓的“真菌公路”既是细菌的运输系统，也是水和营养物质的运输系统，因此在构建微生物网络中可以发挥重要作用。尽管有这些例子，在微生物组内的交流和相互作用仍然缺乏研究，并将受益于更多关于所有微生物组成员的代谢相互作用的知识。在这里，还原的实验模型和模型微生物群落可以帮助识别微生物和参与复杂相互作用的分子机制。
生物信息网络和共现分析提供了有关微生物相互作用模式复杂性的观点，但它们不适合阐明这些相互作用的本质(图3b)。在微生物共现网络中，中心物种用与其他物种联系程度最高的节点表示(图3b)。共现分析也可应用于不同的尺度，如群落尺度上的生态系统间共现模式、群落内共现微生物的模块、嵌套在微生物群落内的模块内的共现对。共现分析也可应用于不同的尺度，如群落尺度上的生态系统间共现模式、群落内共现微生物的模块、嵌套在微生物群落内的模块内的共现对。它们可能与定殖抗性有关，定殖抗性决定了外来微生物入侵本地群落的可能性，并可被视为假说生成的重要工具。然而，特定类型微生物相互作用的存在及其对种群动态或功能的影响，需要在相关模型系统中进行测试(图3c)。重点物种在不同物种间的相互作用中发挥关键作用，对生态系统的性能和动态具有比其他物种更大的影响。然而，在一个联合网络中的枢纽物种不一定扮演一个关键物种的角色。后者的特性还必须通过适当的方法加以确认和补充。枢纽和拱心石类群确实需要更好地了解它们在原位的功能。此外，它们还可以集成在计算方法中，以连接微观和宏观生态问题。从实践的角度来看，指标类群的概念已经获得了很大的兴趣，并从宏观生态学转移到微生物组研究，现在经常被使用，例如，评估农业做法对微生物群的影响[88]或疾病对人类微生物群的影响; 与这里一样，可以使用简单且高度标准化的基于qPCR的方法进行分析。
图3 微生物相互作用可视化通过微生物共现网络。微生物间的相互作用受环境因素的影响，可分为正相互作用、中性相互作用和负相互作用。微生物共现和共排斥网络有助于可视化微生物相互作用。在这样的网络中，节点通常代表微生物类群，而边缘则代表节点之间具有统计意义的关联。绿色边缘通常为正相互作用，而红色边缘则为微生物之间的负相互作用。c要全面研究微生物相互作用，需要对相关模型系统的网络分析得出的假设进行检验。
5 考虑微生物区系的时空变化
微生物群落的时间和空间结构问题对于理解微生物群落的一般功能是重要的。一般来说，最初描述的大型生物的大小多样性关系在不同生态系统中的微生物群落中也得到了证明。微生物组内的时间动态可以从秒或分钟的尺度来评估，反映信使RNA的时间跨度到数百年或数千年的尺度，在这期间微生物与它们的宿主或在一个特定的环境中共同进化。细菌mRNA的半衰期取决于转录的基因，但通常在几分钟的范围内，而来自古细菌基因的转录则更长，有报道数小时的时间。重要的是，尽管过去许多作者将微生物活性与rRNA含量联系在一起，但最近的研究表明这一概念有严重的局限性，只有mRNA可以被认为是代谢状态的可靠指标。仔细考虑感兴趣的寄主的具体特征，如昼夜节律、季节变化或与寄主生物生理相关的生长阶段，可能有助于确定时间动态评估的最佳尺度(图4)。Stegen et al.建议考虑三类因素:(i)生物和非生物历史;(ii)内部动态;(iii)外部强迫因素作为影响微生物群落时间动态的因素。考虑到空间尺度，可能意味着要比较遥远地区之间的微生物模式，以及同一生境的栖息地之间不太明显的差异(图4b)。土壤主要由微团聚体(<0.25 mm)和大团聚体(0.25至2 mm)组成，微团聚体结合土壤有机碳，使其免受侵蚀，而大团聚体限制氧气扩散并调节水流;每个聚集体提供一个独特的生态位，其特有的微生物组结构。然而，“有鸡还是有蛋”这个问题的答案(土壤微生物群的变化是导致了植物多样性的变化，还是相反?)仍然不清楚。微生物群对寄主的定植也不是统一的。例如，众所周知，与根相比，叶子拥有不同的微生物群，根本身被不同的微生物定殖，沿着根际的长度，根表面和根内部都有不同的微生物群。和植物一样，人体也不是由单一的微生物组成的:人体的每个隔间都有自己的微生物，甚至一个身体部位的微生物群也可能因取样区域的不同而不同(例如，皮肤微生物群)。微生物热点和热点时刻通常是紧密相连的。在热点地区，活跃代谢微生物的比例比非热点地区高出2-20倍，使得与微生物活性较低的地区相比，热点地区微生物群落结构和功能的时间变化更具动态性。
图4 微生物群落在时间和规模上的动态。微生物群落的空间动力学特征是在空间上分离的相似生境之间微生物组成的变化。这种分离可能存在于生物体之间(例如，生长在两个不同位置的同一种植物)，一个生物体的各个部分之间(例如，植物的根和整个植物)，甚至一个器官内部(例如，比较不同肠段的微生物群)。
6 定义核心微生物群
基于共生分析和捕捉微生物群落时空动态的实验数据，研究人员试图定义一个核心微生物群。这确实是有益的，因为本地的微生物群落通常是高度复杂的，包括横跨不同领域的数千个物种。确定核心微生物群可以促进对微生物群中稳定和永久成员的区分，而这些群体可能是间歇性的，只与特定的微生物群状态有关，或局限于特定的环境条件。最近，Toju等人提出了核心微生物群的概念，专门用于将农业生态系统管理为物种丰富的群落;他们将核心定义为“形成相互作用核心的一系列微生物，可用于优化单个植物和生态系统水平上的微生物功能。虽然在定义核心微生物时必须谨慎，但幸运的是，总体结果似乎对核心定义的变化相对不敏感。短暂的微生物群随着时间的推移而改变，这取决于环境条件、营养的可用性和/或生长和健康阶段，甚至宿主的昼夜节律。相比之下，“核心”微生物群似乎保持相当稳定。在时间动态方面，核心微生物群描述了与特定宿主基因型或特定环境不断相关的微生物群落(图4a)。这一概念的例外也被描述过，例如，在最佳适应反复发生的水化/脱水循环的微生物群中，不同的细菌群落在循环中履行不同的功能:两者都属于核心。同样，在空间尺度上，例如考虑植物生长在同一地块或同一地理区域的一系列土壤中，核心微生物群不会发生变化(图4b)。
7 从功能预测到表现型
目前可用的微生物组学研究方法，即所谓的多组学，范围从高通量分离(培养学)和可视化(显微镜)，以分类组成为目标(代谢编码)，或解决代谢潜力(功能基因的代谢编码，元基因组学)，以分析微生物活性(元转录组学，宏蛋白质组学，代谢组学)(图5)。基于元基因组数据，可以重建微生物基因组。虽然最初的宏基因组组装基因组是从环境样本中重建出来的，但近年来，数千个细菌基因组被丢弃，而没有进行微生物培养。然而，由于一方面微生物组DNA序列数据的大量可用性与另一方面确认基因功能的元基因组预测所需的微生物分离物的有限可用性之间的缺失，我们的理解仍然非常有限。元基因组数据为新的预测提供了一个平台，但还需要更多的数据来加强序列和严格函数预测之间的联系。考虑到一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代可能导致根本的功能改变，从而导致对给定基因序列的功能分配不正确，这一点就变得显而易见了。显然需要更多的经典微生物学，包括使用靶向突变体与微生物生物化学相结合，以应对这一挑战。此外，对已经发现但功能未知的蛋白质家族进行全面的功能表征，比进一步扩展这些家族的列表，有更多的收获。近年来，人类肠道菌群的参考基因组和培养标本都是通过高通量培养建立的。
理解原核生物的功能多样性是非常具有挑战性的，因为目前已经确定的有85种118门至今还没有一个物种被描述。最后，原核生物门的数量可能达到数百个，而古生门是研究最少的。纯培养中细菌和古菌的多样性与用分子方法检测到的差异越来越大，这导致了对尚未培养的类群建立正式命名法的提议，主要基于序列信息。建议的改变《国际原核生物命名法》对以下问题提出了关注:
(1)命名法的可靠性和稳定性;
(2)参考基因组的技术和概念局限性以及可用性;
(3)硅功能预测的信息含量;
(4)微生物多样性进化单元的识别。
这些挑战需要克服，以达到一个有意义的分类尚未培养的原核生物，目前，对表型知之甚少。对于某些微生境，特别是那些营养成分含量高、微生物活性高的微生境，可培养的代表性菌株相对于测序检测到的分子物种的比例从35增加到65%，正如肠道菌群所述。然而，它们的系统发育和分类比较复杂，研究较少。有趣的是，不同环境下的无引物16S和18S rRNA基因测序显示，在微真核生物中存在大量之前未检测到的类群。除了当前使用的计算机模拟比较和培养方法外，还可以使用一组同位素探测技术直接测试复杂微生物群落中的功能假设。这些方法包括DNA-、RNA-、蛋白质-和脂质稳定同位素探测(SIP)，以及鱼-微放射学、鱼-纳米sims和鱼-拉曼微光谱，后三种方法提供单细胞分辨率。随后，利用RACS平台从复杂的微生物群系中筛选出活性代谢粘蛋白的氘标记细胞，并通过单细胞基因组学和培养方法进行进一步分析。这种方法允许以一种新的免栽培方式将微生物代谢表型与其基因型联系起来，因此可以直接从微生物潜能处理到微生物功能(图5)。尽管它的进步，这个功能分类平台的吞吐量仍然是有限的，和互补的新技术解决方案，如组合FISH和生物正交非典型氨基酸标记(BONCAT)将有助于微生物研究中更迫切需要的以表型为中心的研究。
图5 评估微生物功能的方法。复杂的微生物组研究涵盖了不同的领域，从完整的微生物细胞水平(显微镜、培养)开始，接着是DNA(单细胞基因组学、代谢编码、元基因组学)、RNA(元转录组学)、蛋白质(宏蛋白质组学)和代谢物(代谢组学)。按照这个顺序，研究的重点从微生物潜力(了解给定栖息地中可用的微生物群)转移到代谢潜力(破译可用的遗传物质)，转向微生物功能(例如，发现活跃的代谢途径)。
8 宿主共同进化
宿主与相关微生物的密切关系产生了宿主及其相关微生物群的共同进化理论。一个例子是早期陆生植物的建立得到了共生真菌的促进，这表明自从微生物第一次出现在陆地上，植物就与微生物共同进化。另一个例子是真核生物本身;线粒体和质体是真核细胞中的细胞器，它们是从共生细菌中衍生出来的，在整个共同进化过程中，它们完全依赖于宿主，反之亦然。考虑宿主微生物的共同进化是很重要的，以促进对微生物群的整体理解(图6)。根据他们的解释，拮抗共同进化包括宿主-寄生相互作用，而互惠共同进化则以正向相互作用为主(图6)。这种积极的相互作用可能朝着专性共生、垂直遗传和代谢协作的方向发展(图6)。：根据微生物与宿主的相互作用对病原微生物、有益微生物和中性微生物进行分类，可能有助于微菌相互作用在介导宿主适应度方面发挥核心作用的研究，如医学研究。此外，在许多环境研究中，可能没有特定的宿主在很长一段时间内可用，这使得病原体和受益者的划分无关紧要。与其研究一个特定微生物与其宿主的相互作用，可以考虑基于全息波本论的整体方法(图6)。按照这种方法，宿主与其微生物组的有益相互作用负责维持整体生物的健康，而疾病往往与微生物生态失调有关。在这一生态失调的背景下，“病源体”概念(图6)被建立并应用于多个病源系统，它代表了整合在其生物环境中的病原体。尽管进行了大量的研究，定义了“健康的微生物群”，但生物共生和生态失调之间的边界仍然是未来的主要挑战。进化过程和选择压力显著推动宿主与微生物的相互作用;因此，划分为人为的、以人类为中心的类别会随着时间而改变。宿主-微生物的共同进化导致了与植物和动物相关的特定微生物群。这种特异性的程度受多种因素的影响，在不同的系统发育分支之间存在差异。对于苔藓，代表地球上最古老的陆地植物，一个非常高的植物特异性被描述。这种特异性独立于寄主的地理来源，并在孢子体和配子体之间垂直传播。驯化和育种活动也可以显著地塑造宿主的微生物群，在某些情况下，其影响程度比预期的更大。微生物群消失的理论表明，流行的慢性疾病是由人为微生物群向多样性减少的转变引起的。
图6 对微生物-宿主共同进化的理解从“分离”理论转向整体方法。寄主及其相关的微生物群被认为是相互协同进化的，因此可以用不同的方法来描述协同进化理论。根据“分离”方法(图上半部分)，根据微生物与宿主的相互作用，可将其分为病原体、中性和共生体。宿主与其相关菌群之间的共同进化可以相应地被描述为拮抗(基于消极的相互作用)或互惠(基于积极的相互作用)。最近出现在关于条件致病菌和病理细菌的出版物中，使共进化理论转向了整体方法(图的下方)。整体方法将宿主及其相关的微生物群视为一个整体(所谓的整体)，它们共同进化为一个实体。根据整体方法，holobiont的疾病状态与生态失调、相关微生物群的低多样性以及它们的可变性有关:一种所谓的“病态生物组”状态。另一方面，健康状态伴随着各自菌群的共生性、高多样性和统一性。微生物从一个宿主到另一个宿主以及到环境的动态流动，由一个健康概念所描述，支撑了共同进化的整体方法。
9 微生物研究的未来展望和挑战
随着组学技术的进步，微生物组数据的可用性不断增加，我们对微生物群提高生产力和多样化系统可持续性的潜力的理解急剧增加。应用微生物组研究的宏伟愿景是改善人类、动物、植物和整个生态系统的健康。一般而言，可以直接通过
(i)微生物组移植，
(ii)具有有益特性的微生物，
(iii)微生物活性代谢物，或通过改变环境条件间接管理微生物，使其结构和功能从生态失调转变为健康状态。
当比较基于微生物的人类、动物和种植系统的应用时，可以看到显著的协同作用(图7)。虽然各个领域之间的联系还不是很好，但在所有领域都出现了一种明显的一致趋势。这一趋势涉及到对定制治疗的关注，例如，“下一代”精准农业或个性化医疗(图7)。这一概念认识到，并非所有个体宿主及其相关的本地微生物群落对特定引入的微生物、微生物组移植或代谢物的反应都是相同的。相反，它依赖于对那些特定的寄主-微生物、环境-微生物以及微生物-微生物相互作用的基本理解，这些相互作用介导了微生物组在不同环境中的组合和功能能力。粪便菌群移植是一种被批准的治疗复发和难治性艰难梭菌感染的方法。尽管其功效背后的机制仍不为人所知，但近年来，它的应用范围迅速扩展到胃肠道疾病以外的多个领域，如潜在的肥胖、代谢综合征和肝脏疾病的治疗。总的来说，最近描述的肠脑、肠肝和肠肺轴也强调了健康肠道菌群的重要性，使肠道成为人类健康的中枢器官。
微生物群落的重要性超越了个体宿主的健康。来自不同宿主和生态系统的微生物可以强烈地相互影响。这些观察结果产生了"健康环境促进健康人类"的口号，该口号支持"一个健康概念"。根据世界卫生组织的说法，"同一个健康"是一种设计和实施方案、政策、立法和研究的方法，多个部门在其中进行沟通和合作，以取得更好的公共卫生成果。对“一健康”概念的扩展，包括环境健康及其与人类文化和习惯的关系，表明在社会决策和政策制定中应考虑生活方式微生物与人类健康的联系(图7)。多样性的丧失反过来又与细菌对抗生素耐药性的增加相关，因此需要实施策略来恢复已建环境中的细菌多样性。一些国家和国际生物经济战略也承认这一主题，在这些战略中，可持续的生物产品生产满足经济需求。毫无疑问，要使这些概念成为一个成功的故事，不仅需要在自然科学的不同学科之间，而且需要在社会科学和利益相关者之外的相互关联的战略和整合。而，我们现在所面临的往往是相反的:生物多样性丧失、污染、臭氧耗竭、气候变化、生物地球化学循环边界的跨越，是我们这个时代的人为因素。人类活动已经跨越了九个地球边界中的四个:气候变化、生物圈完整性的丧失、陆地系统的变化以及生物地球化学循环的改变。了解海洋和陆地的微生物群落及其相互作用，无疑是找到解决这些巨大挑战的关键。微生物组管理和以微生物为基础的高潜力创新的发展对各种应用领域都很有希望，但应伴随着对这些有希望的新技术的假定环境影响的仔细评估。
图7 该示意图显示了跨领域的微生物组应用趋势，从宽带应用到基于微生物组的精确处理在微生物研究的所有领域，如农业、人类和动物医学以及生物经济，而通过微生物群落亚群的循环，这些区域之间的相互联系是“一个健康”方法背后的一个基本概念。医学(左)和农业(右)领域微生物组应用之间的协同作用通过水平箭头显示，从宽带应用(上半部分)到精确处理(下半部分)的流程(垂直箭头)。
结论
基于该领域最近的进展，我们建议恢复由Whipps等人提出的微生物组术语的最初定义。这个定义包含了在1988年出版后30年仍然有效的所有重要要点，并通过两句解释性的句子加以扩展，区分术语微生物组和微生物群，并阐明其动态特性。微生物组被定义为一个具有独特的物理化学性质的特征微生物群落，它占据一个合理的明确定义的栖息地。微生物群不仅是指所涉及的微生物，还包括它们的活动场所，从而形成特定的生态位。微生物组是包括真核宿主在内的宏观生态系统的一部分，它形成了一个动态的、相互作用的微生态系统，易于随时间和规模变化，对真核宿主的功能和健康至关重要。微生物群是由属于不同界(原核生物)的微生物组合而成的细菌、古生菌、真核生物。而“它们的活动场所”则包括微生物的结构、代谢物、可移动的遗传元素(例如，转座子、噬菌体和病毒)，以及嵌入在栖息地环境条件中的遗留DNA。
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