科研| 清华大学Water Research：藻华暴发期间微生物群落和代谢活动的时间异质性
编译：小憨豆，编辑：小菌菌、江舜尧。
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阐明藻类与相关微生物群落之间的相互作用对于理解海洋环境中有害藻华(HABs)的动态调节机制至关重要。然而，微生物的功能和其生物地球化学潜力在HAB过程仍然是难以捉摸的，特别是在一个完整的自然藻华期间。在这里，使用焦磷酸测序和功能基因芯片(GeoChip)来调查夜光藻暴发期间微生物群落动态和代谢潜力。结果表明，浮游细菌在藻华期间表现出明显的时间异质性。微生物的演替是由环境参数和生物相互作用共同驱动的。功能分析揭示了物质循环过程中微生物代谢的显著变化。在暴发期，与铁氧化和铁转运相关的代谢电位升高。碳固定、降解、反硝化、磷吸收和硫氧化显著增强。在衰退期，氧化应激、化合物裂解、毒素降解和蛋白酶合成增加。研究结果表明，藻际微生物可以提高有机物碳的分解能力，改变氮同化率和硫/磷周转效率，平衡HAB过程中的铁消耗。生态连锁分析进一步表明，微生物组成和功能潜力与藻华的发生有显著的关联。这说明微生物群落的结构变异和功能可塑性影响着HAB的运行轨迹。
论文ID
原名：Temporal heterogeneity of microbial communities and metabolic activities during a natural algal bloom
译名：藻华暴发期间微生物群落和代谢活动的时间异质性
期刊：Water Research
IF：8.140
发表时间：2020.6
通讯作者：蔡中华
通讯作者单位：清华大学深圳国际研究生院
实验设计
本研究在中国深圳东冲沿海地区进行采样，该地区经常暴发夜光藻藻华。为了获得一套完整的藻华样本，研究者通过跟踪采样，每周两次对浮游植物浓度进行监测。2016年2月3日至16日发生藻华，共采取了14个藻华周期时间点样品，分别标记为DC1至DC14。在每个采样时间点测量了温度、盐度和pH等物理参数，叶绿素a、荧光比和营养盐等化学参数以及细菌丰度和藻类生物量等生物参数。从样品中提取DNA并进行纯化，使用特异性引物扩增16S(原核生物)和18S(真核生物)rRNA基因。用Mothur和Qiime软件进行数据处理，igraph和Cytoscape进行网络分析，Vegan和Plspm等R包进行数据统计分析。
结果
1. 藻华暴发特征
研究者在藻华暴发五个阶段获得了样品:I，藻华前期(DC1)；II，起始期(DC2、DC3)；III，平台期(DC4、DC5)；IV,衰退期(DC6-DC10)；V，凋亡期(DC11-DC14)。藻华在形态上被鉴定为夜光藻。藻细胞数为1.05×102 ~ 2.53×103 cells/ml，在DC4出现峰值，同时出现最大叶绿素a和藻密度。在采样期间，物理参数(温度、盐度和pH值)、生物参数(细菌和藻类丰度)和化学参数（叶绿素a浓度、Fv/Fm比率和营养盐等）与之前的研究结果一致。此外，铁(Fe3+)浓度在起始期(DC3)较低，总有机碳(TOC)在前期至中期(DC1-DC6)从6.1 mg/l增加到8.2 mg/l，在藻华期(DC7-DC12)达到峰值(12.6-14.3 191 mg/l)，然后逐渐下降，在5.5-6.9 mg/l之间波动。
Fig0:藻华事件
2．微生物群落结构和关联网络
随着藻华的暴发，细菌群落组成发生了显著变化(图1A)。Alphaproteobacteria，Gammaproteobacteria和Flavobacteriia在暴发期占优势。FCB组成员(Bacteroides, Polaribacter 和Flavobacterium)的相对丰度分别增加3.7倍、2.6倍和2.2倍，在藻华过程中，在平台期达到高峰。除细菌外，古菌群落也有差异(图1B)。Methanocellaceae主要在起始期, Methanomicrobiaceae和Methanocorpusculaceae在平台期最丰富, Halobacteriaceae和Cenarchaeaceae在衰退期和凋亡期丰度高。在18S OUT水平上，甲藻(尤其是夜光藻)随着藻华的暴发而更加普遍(图1C)。结果表明，HAB事件发生时，不同时间点藻类群落结构有明显的变化。对不同暴发期16S和18S rRNA基因序列的聚类分析进一步证实了这一点。
Fig1：不同藻华时期的细菌(A)、古细菌(B)和真核生物(C)群落组成(目水平)。
为了确定可能的因素影响观察到的微生物群落结构变化，进行CCA分析。群落组成(16S)和分布受温度、NO3-和NH4+浓度以及TOC的显著影响。同时，PO43−、NH4+和Fe3+水平是与微真核生物(18S)种群变化相关的主要因素。Mantel检验表明，生物群落之间的相关性比物理化学参数的相关性更强。通过网络共现分析，发现在科水平上分析的主要微生物之间存在复杂的相互作用，包括互惠共生、竞争、互食、寄生和捕食。Rickettsiaceae、NS 11-12、Saprospriaceae、Winogradskyella、Flavobacteriaceae和Chitinophagaceae是该网络中潜在的关键类群(图2A)，这也揭示了群落成员与环境变量之间的关系以及滞后的相互依赖关系。总体而言，我们发现了76个群落之间的滞后相关性(图2A)，表明时移的相互依赖性可能在浮游细菌群落中普遍存在。构建了一个共现网络，进一步阐明了主要植物层物种与闪烁藻的相关性，结果表明，夜光藻藻华的形成受Plesiocysis、Lentisphaeraceae、Thalassomonas、Marinicellaceae和Vibrio的影响，而藻华的消亡受Winogradskyella、Oleiphilaceae、浮游植物(Gryodinium、Skeletonema、Alexandrium)以及一些浮游动物(如Amoebophrya和Syndiniales)的影响(图2B)。
Fig2：微生物关联网络。
3. 微生物功能的一般模式
为了阐明HAB期间微生物的功能，使用来自不同时间点的7个具有代表性的样本进行了GeoChip分析，即起始期(DC3)、平台期(DC4和DC5)、衰退期(DC6、DC7和DC9)和凋亡期(DC13)阶段。HAB总体功能概要如图3所示。两组的铁/电子转移和次生代谢电位在暴发期间出现增高。有机质修复和氮磷利用是平台期的主要途径。有趣的是，在衰退阶段，与各种新陈代谢相关的基因被耗尽，而与应激反应、硫代谢和其他生理活动如金属稳态相关的基因被富集。衰退期时，负责C-N代谢和环境适应的基因最为丰富。
Fig3: Geochip分析与藻华暴发相关的微生物功能。
4. 参与碳(C)和氮(N)循环的关键功能基因
对于碳的降解，纤维素、木质素和淀粉是最丰富的碳来源。因此，编码纤维素酶、乳糖酶和葡萄糖淀粉酶的微生物基因数量相对较多。另外，参与相对不稳定的碳基分子降解的基因在藻华中期或后期都有很高的代表性(图4A)。此外，微生物在这些阶段表现出更大的能力降解顽固性碳，包括乙二醛氧化酶(glx)、锰过氧化物酶(mnp)和苯酚氧化酶。这种降解的主要贡献者是Alphaproteobacteria、Deltaproteobacteria和Zetaproteobacteria。与主要生物分子相关的基因如amoa-quasi、camdcab和lmo在平台期或衰退期不同程度地富集。
本研究检测到两种主要的碳固定途径，即乙醛酸循环(aceA和aceB)和甲烷生成(aprA和dsrA)(图4A)。两种途径的组分在后期富集，特别是在平台期富集。这些结果表明，在HAB过程中，碳固定电位分别通过一氧化碳脱氢酶和丙酰/乙酰辅酶a羧化酶调节的还原乙酰辅酶(CoA)和3-羟基丙酸/malyl-CoA循环途径增强。在这两条通路中分别鉴定了356个基因和402个基因，其中Betaproteobacteria、Solibacteres、Synergistia、Thaumarchaeota和Verrucomicrobia为主要贡献者。
在氮循环过程中，反硝化、同化、氨化和硝化的相关基因按照HAB阶段差异表达(图4B)。在平台期，相当数量(583)的反硝化基因较其他阶段富集1800% - 250%，特别是nirk和nirs。两个参与N同化的基因(amyA和anyX)在HAB事件中表现出相对丰度增加，并遵循相似的模式。在nirb基因中也观察到类似的趋势，它参与了同化氮的减少。在平台期，nirb的表达量是藻华暴发期的3倍，暴发后仍保持在1.2-1.5倍。本研究仅检测到1个氨化基因(urec)，平台期比暴发期高61.2%。不同阶段的硝化作用相关基因表达无差异。氮循环基因主要与细菌和古菌相关。其中，Proteobacteria对氨硝化和反硝化的反应，FCB和PVC组参与同化氮的还原，以及参与硝化和产甲烷过程的古菌。
Fig4：不同HAB阶段涉及碳降解(A)、氮循环(B)、P/S代谢(C)、铁循环(D)和微生物胁迫(E)的关键基因的归一化信号强度。
5. 参与磷(P)/硫(S)/铁(Fe)代谢的功能基因
对于与植酸水解、多聚磷酸盐合成、多聚磷酸盐降解和磷氧化四种磷利用途径相关的基因根据HAB阶段差异表达。例如，ppk相对水平在其他各期均较藻华起始期升高，特别是在平台期(3倍以上)。研究发现检测到的ppx基因中，Bacteroidia占一半以上，其次是Coriobacteriia和Bacilli。HAB事件中P氧化无明显变化，分别为5f1-htxA、5f1_ppn和5fi。PtxD基因水平在各阶段间无统计学差异。
硫循环基因的丰度与磷循环基因的丰度呈现相似的趋势，在藻华起始时先增加，在衰落期逐渐减少。dsrB是藻华期唯一表达差异显著的硫还原基因。在HAB事件中，共有218个亚硫酸盐还原相关基因差异表达，dsrB编码的亚硫酸钠还原酶占这些基因的近50%，归因于Firmicutes(27.4%)、Fibrobacteres(23.5%)、Crenarchaeota(19.7%)和Chlorobi (11.6%)。三个亚硫酸盐氧化基因(soxA、sox和soxY)在每个检测时间点富集。内切葡聚糖酶是一种重要的酶，可用于其他方面的硫利用，如二甲磺酸丙酸(DMSP)降解。共173个参与DMSP降解的基因表现出正信号强度，尤其是在藻华暴发期。
在检测到的1352个铁循环基因中，bfr、cirA、fecA、feoB、fepA_iron、iro等参与铁氧化的基因占62.8%，大多数在暴发期丰度最高(图4D)。与铁氧化相比，7个铁储存基因(fhuA、fhuE、fiu、fptd、fyuA、hxuC和dps)在平台期富集。铁亲和力和转运相关基因分别在平台期和起始期表达差异，2个铁亲和力基因在平台期增强，3个铁转运基因在起始期降低。这两组基因都在HAB的平台期富集。
6. 在藻际微生物中的胁迫相关基因
大约有16个胁迫相关的基因家族在HAB各阶段表现出可变表达。介导温度胁迫、饥饿、酸碱平衡和包膜胁迫反应的基因在平台期富集，而与氧化应激、渗透压胁迫、氧限制、裂解、毒素和蛋白酶压力相关的基因在衰亡期高表达(图4E)。大部分基因可归因于Proteobacteria，其次是FCB，Firmicutes,Cyanobacteria和Actinobacteria。此外，一些Euryachaeota和真菌基因也参与了这一过程。大多数被检测的属是已知的代谢通用和参与多种物质循环过程。
Fig5：(A)Geochip数据和环境因子的相关性分析；（B）环境参数、微生物组成和物质代谢与HAB的生态联系。
7. 环境参数、微生物功能特征与HAB事件之间的生态学联系
进行CCA是为了确定在HAB过程中，环境变量是否对功能基因丰度差异有贡献(图5A)。前两个典型轴解释了显著改变的功能基因水平中约束变异的31.4%和30.5%。不同阶段的样品沿第一个标准轴分离良好，该轴与TOC、PO43−、NO3−浓度和温度呈正相关(图5A)。第二个轴与NH4+水平和pH呈正相关，与NO2−水平和盐度呈负相关。环境变量与微生物功能的相关性表明，温度是影响藻华开始时微生物群落结构的主要因素，氮和磷有效性影响平台期结构，在衰亡阶段，pH值的影响最大。
为了更好地整合这些复杂的相互关系，构建了PLS-PM模型，将功能基因丰度与HAB事件关联起来(图5B)。藻华的形成一般与微生物代谢、群落组成和环境因子有关。功能基因中，C、P、Fe、N、S代谢对细胞浓度有明显影响，表明物质代谢是影响藻华发生的重要因素。
Fig6：以功能群落为主的微生物群落对藻华过程的反应的概念图。
结论
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