科研 | AR：与强直性脊柱炎和类风湿性关节炎风险相关的人类白细胞抗原等位基因影响肠道微生物群
编译：ye00ye，编辑：十九、江舜尧。
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人类白细胞抗原（HLA）等位基因影响100多种疾病的易感性，但是解释这些基因型-疾病关联的机制在很大程度上是未知的。HLA等位基因影响强直性脊柱炎（AS）和类风湿性关节炎（RA）的易感性。AS和RA患者都有离散的肠道和粪便微生物群落特征。这些变化是疾病本身的原因还是结果尚不清楚。为了区分这些可能性，我们检测了HLA-B27和HLA-DRB1风险等位基因对健康个体肠道微生物组成的影响。从107名健康的无关受试者中收集了来自6个肠道部位的568份粪便和活检样本，并从TwinsUK基金项目中的696对双胞胎中收集了粪便样本。使用16S核糖体RNA细菌标记基因测序进行微生物体分析。使用Illumina CoreExome基因芯片对所有受试者进行基因分型，并根据这些数据估算HLA基因型。观察到总体微生物组成与HLA-B27基因型和HLA-DRB1风险等位基因之间的关联。使用TwinsUK提供的粪便样本复制了这些关联。这项研究表明：在AS和RA患者中，肠道菌群组成的变化部分来自于HLA-B27和HLA-DRB1的影响。这些发现支持了HLA等位基因通过与肠道微生物相互作用导致或增加这些疾病风险的假说，并表明针对微生物的治疗可能在预防或治疗这些疾病中有效。
论文ID
原名：HLA Alleles Associated With Risk of Ankylosing Spondylitis and Rheumatoid Arthritis Influence the Gut Microbiome
译名：与强直性脊柱炎和类风湿性关节炎风险相关的人类白细胞抗原等位基因影响肠道微生物群
期刊：Arthritis & Rheumatology
IF：9.002
发表时间：2019年
通信作者：Matthew A. Brown
通信作者单位：澳大利亚昆士兰科技大学健康与生物医学创新研究所
简介
已知HLA基因会影响对许多疾病的易感性，对于其诱发机制我们不甚了解。强直性脊柱炎（AS）和类风湿性关节炎（RA）的发病风险主要受遗传效应驱动。在这两种疾病中，HLA等位基因是主要的诱导因素，其中AS与HLA-B27密切相关，RA与HLA-DRB1相关。
有证据表明：特别是在AS的发病患者中，很多同时还患有肠道疾病。估计高达70%的AS患者同时患有不同程度的肠道疾病。与健康对照相比，AS患者及其直系亲属的肠道通透性增加。克罗恩病（CD）与AS密切相关，具有相似的患病率和较高的遗传率。约5%的AS患者会患上CD，4-10%的CD患者会患上AS。AS和炎症性肠病(IBD)这两种疾病之间的强共发性和遗传因素的高重叠性表明：其发病机制可能相同。这与肠道来源的免疫细胞或微生物产物可能导致脊椎关节炎炎症的假设相一致。
16S rRNA群落特征分析已经表明：与健康对照相比，AS患者在回肠末端具有离散的肠道微生物特征(P < 0.001)。在肠道或关节出现临床疾病之前，生理失调是HLA-B27转基因大鼠的早期疾病特征。类似地，动物实验表明：RA患者会出现肠道菌群失调。这些研究表明，肠道微生物群的改变会影响免疫功能。
动物模型表明：宿主基因缺失会导致微生物群落的改变。此外，最近在交叉鼠模型中进行的定量性状位点定位研究将特殊的遗传多态性与微生物丰度联系起来。对双胞胎(n = 1,126对)的大规模研究表明，在945个广泛共享的分类群中，8.8%显示出显著的遗传效应，一些分类群的遗传效用大于40%。
以下问题需要探讨：宿主遗传效应是否会影响到肠道微生物组成的变化，以及如何影响肠道微生物的整体功能，包括微生物随后如何参与免疫反应和影响炎症。
在本研究中，我们主要检验如下假设：AS和RA相关的HLA等位基因影响健康个体的肠道微生物群，并进而影响AS和RA发病风险。
实验设计
样本来源：共有107名在俄勒冈健康与科学大学健康与康复中心接受常规结直肠癌筛查的受试者被纳入本研究。受试者年龄为40-75岁，通常遵循杂食性饮食(约95%)。大多数(约90%)是白人。如果个人有IBD或结肠癌的个人病史，做过肠道手术，或怀孕，则被排除在外。所有受试者在结肠镜检查前一天都接受了标准聚乙二醇肠道制剂。在检查过程中，从回肠末端或其他组织部位采集活检样本。受试者被要求在开始肠道准备程序之前，在家里用无菌拭子收集粪便样本。粪便样本在室温下进行结肠镜检查。所有样本(活组织检查和粪便拭子)在结肠镜检查程序后于4℃保存并在2小时内被运送到实验室，在那里进行速冻并在处理前储存在80℃下。患者样本是在24个月的时间内获得的。
从1392对双胞胎中收集了匹配的基因型和粪便样本，并进行基因分型、16S rRNA扩增子测序、过滤和分析。
基因分型：根据标准方案，从粘膜活检组织和粪便样品中提取DNA，并使用Illumina CoreExome SNP进行基因分型。对每个样品的珠强度数据进行处理并进行标准化，并使用Genome Studio(Illumina)进行基因分型。使用SNP2HLA估算了HLA-B基因型。
16S rRNA的扩增子测序及分析：如前所述，从107名个体中提取568份粪便和活检样本，并扩增细菌16S rRNA标记基因。使用在线平台BaseSpace对样本进行分类和质量过滤。使用QIIME 1.9.1对成对末端序列进行拼接、质量过滤和分析。序列基于封闭的参考数据库被聚类到各OTU，数据库使用的是Greengenes database(gg_13_8)，通过UCLUST以97%的相似性聚集，低丰度OTUs被去除(< 0.01%)。
数据可视化和统计分析：多维数据可视化是使用稀疏偏最小二乘判别分析(sPLSDA)对中心对数比转换数据进行的，作为混合组学软件包版本6.3.1 的一部分在R中实现。使用变异多元方差分析(PERMANOVA)测试微生物与元数据之间的关联。α多样性是在物种水平上使用R-vegan中的稀疏函数计算的，使用威尔科克森秩和检验评估差异。使用PICRUSt版本1.1.3 预测宏基因组功能，并使用HUMAn 0.11.1 将所得预测映射到KEGG途径。使用MaaSlin 0.0.5测试了不同丰度的细菌分类群和KEGG途径的显著性。
结果
研究了体重指数、性别和取样部位对肠道微生物群的影响以确定相关协变量，用于分析AS相关基因及其与肠道微生物群的关联。根据样品位置的不同观察到显著差异，特别是粪便样品和粘膜样品(P < 0.0001)(图1A)。从分析中排除粪便样本时，仍然观察到位点之间的显著差异(P < 0.0001)。这主要受回肠样本和聚集在一起的结肠粘膜样本(左右结肠、盲肠、直肠)之间的差异驱动(图1B)。
鉴于先前在AS患者中主要并发回肠炎症，我们对回肠和粪便微生物群之间的关系进行了分析。对比观察到位点之间的显著差异(P < 0.0001)，尽管在sPLSDA图上可以看到一些重叠。
在几项研究中，显示AS患者α多样性指标有增加、减少或无变化，RA患者α多样性有显示增加或减少。在本研究中，对稀有物种丰富度的计算显示，携带HLA-B27和HLA-DRB1等位基因与α多样性的差异无关。粪便样本是例外：HLA-DRB1 RA风险等位基因与两个群体中α多样性的增加有关(图2)。
通过sPLSDA和PERMANOVA评估β多样性，观察到体重指数类别和微生物组成之间存在显著关联(P = 0.0022)。这似乎是由体重不足的受试者(体重指数< 18.5)与其他体重指数类别的差异造成的。当将体重不足受试者的样本排除在外并重新分析时，体重指数和微生物组成之间的联系有不显著的趋势(P = 0.078)，这与以前的发现一致。
考虑到RA和AS对男性和女性的影响程度不同，以及(在小鼠中)与性别相关的激素差异与肠道微生物体差异相关联，评估了性别对受试者体内微生物群落的影响。虽然微生物群落分布图中有明显的重叠，但观察到了显著的差异(所有点加起来，P = 0.0004)。当研究指示物种时，在男性受试者中观察到普雷沃氏菌属的携带显著减少(P = 0.005)。
在控制体重指数和性别后，在携带HLA- B27或HLA-DRB1 RA等位基因的个体中发现了微生物群的显著分化(分别为：PERMANOVA P = 0.002和P = 0.0001)(图3A和3B)。尽管在β多样性方面存在显著差异，但α多样性通常没有差异(图2)，这表明潜在的宿主基因可能影响微生物体的整体组成，但不会影响物种的整体多样性。在TwinsUK项目中，随机抽取双胞胎中的一个，并研究粪便样本。观察到粪便微生物群组成与HLAB27和HLADRB1风险等位基因相关(分别为0.023和0.033，图3C)。对每对双胞胎中另一个的样本进行的研究观察到一致的发现。这些分类和功能组成的差异在我们的两个研究群体之间是否一致还有待观察，因为由于实验方法和调查人群的差异，观察到的结果还需进一步验证。
我们测试了与AS相关的HLA-B等位基因是否也与肠道微生物相关。观察到AS与HLA-B27、B13、B40、B47和B51的风险关联，与HLA-B7和B57的保护性关联也被观察到。其中，只有B27在两个群体中显示出与微生物群落变化存在统计学意义上的关联。风险相关等位基因和保护性等位基因进行比较时，微生物组成的差异更加明显。例如，当聚焦于一个子集 (回肠样本)时，我们观察到微生物群落对B27有边际差异(P = 0.16)，对B7却无差异(P = 0.61)，这可能是由于样本大小的不同所导致。然而，B27和B7的微生物群落的直接比较仍揭示了显著的差异(P = 0.008)。
HLA-B27阳性受试者显示卵形杆菌在多个部位(回肠、盲肠、左结肠、右结肠和粪便)的携带减少(P < 0.05)，布劳特氏菌(左结肠和右结肠)和产甲酸多尔氏菌(直肠和粪便)的携带也有减少。在多个位点(左结肠、右结肠、直肠和粪便)观察到一种罗斯拜瑞氏菌属物种携带增加，奈瑟球菌科(盲肠和回肠)也是如此。对于对HLA-DRB1受体风险等位基因呈阳性的受试者，多个位点富集了许多分类群，特别是毛螺菌属物种(回肠、盲肠、左结肠、右结肠和直肠)、梭菌科物种(左结肠、右结肠、直肠和粪便)、长双歧杆菌(盲肠、右结肠和直肠)等。在携带风险等位基因的受试者回肠中也观察到瘤胃球菌属的富集。有趣的是，当考虑到错误发现率时，没有一个单一的分类单元与被调查的基因组类型显著相关，这表明通过PERMANOVA检测到的群落水平差异可能是由大量分类单元的细微变化驱动的，而不是少数几个分类单元的显著变化。
考虑到推测的HLA-B27阳性和阴性受试者的代谢谱，我们观察到许多KEGG途径的多个位点之间存在显著差异(P < 0.05)。例子包括鞭毛装配(回肠，盲肠、左结肠、右结肠和直肠)、丙氨酸代谢(盲肠、回肠、左结肠和右结肠)、赖氨酸生物合成(左结肠和右结肠)、降解(回肠、直肠和粪便)和次生胆汁酸生物合成(回肠和粪便)。对于HLA-DRB1受体风险等位基因，还观察到KEGG途径的许多差异。实例包括硫胺素代谢、柠檬酸循环、脂多糖生物合成论文、安山霉素的甘油酯代谢生物合成、核糖核酸转运和细菌趋化性，所有这些在每个组织部位活检中都有差异。
讨论
在这项研究中，我们首次证明在没有疾病或治疗的情况下，HLA-B27和HLA-DRB1对人体肠道微生物群有显著影响。这与在小鼠实验中观察到的HLA-DRB1与肠道微生物群落特征的关联以及人体中HLA-DRB1等位基因对粪便普雷沃氏菌丰度的影响是一致的。通过确认肠道失调部分是由于AS和RA的主要遗传风险因素（HLAB27和HLADRB1风险等位基因）所造成的，我们扩展了以前的观察：AS和RA的特征是肠道失调。
研究证明腔内粪便样品和粘膜样品以及来自不同肠部位的粘膜样品之间的微生物群落存在明显区别。值得注意的是，回肠和粪便样本之间存在显著差异。
在一项对27名SpA患者(不一定是AS)和15名健康对照进行的研究中，采用16S rRNA测序分析，蒂托等人报告了回肠或结肠粘膜活检样本中杆菌属的存在与疾病活动性的关联，疾病活动性由自我报告的Bath AS疾病活动性指数(BASDAI)和AS疾病活动评分来作估测。研究没有观察到杆菌属，因此不能确认它是否与HLA-B27携带有关。
在一项来自中国的研究中，温等人对97名AS患者和114名健康对照者的粪便样本进行了鸟枪测序，并报告AS患者存在明显的肠道失调。Breban等人对粪便微生物群进行了16S rRNA分析，研究了87名脊柱关节炎患者(42名AS患者)、69名健康对照者和28名RA患者。他们也发现了SpA患者肠道失调的现象，以及活泼瘤胃球菌携带与BASDAI评分的相关性。
这些研究之间的差异可能与分析上的差异有关，如协变量的处理、疾病定义、研究样本位点、种族和饮食，以及用于描述微生物群的不同方法。本研究还证实了性别和体重指数类别对肠道微生物特征的显著影响，提示未来的研究应该控制这些协变量。最近的一项研究表明HLA分子可能对微生物群组成有更普遍的影响，而不是对特定分类群有显著的影响。
HLA分子影响对许多疾病的易感性，其中大多数是免疫介导的。其中的具体机制尚不清楚。微生物群现在与大部分疾病有牵连，其中许多是免疫介导的。发现表明，HLA分子可能是导致微生物群落异质性的重要因素，并且至少部分通过这种机制在许多疾病的发病机制中起作用，而不仅仅是AS和RA。
在HLA-B27转基因SpA大鼠模型的研究中观察到许多依赖HLA-B27的代谢变化，包括胆汁酸代谢、赖氨酸代谢、脂肪酸代谢和色氨酸代谢的富集。所有这些途径都被预测在HLA-B27阳性个体中广泛存在。重要的是，在该模型中，HLA-B27依赖的生物失调在发病前被观察到。因此，人类和大鼠研究支持这样一个假设，即HLA-B27依赖性生理障碍是AS发病机制中的前一事件，可能不仅仅是继发疾病。
总之，这项研究表明人体携带的HLA-B27和HLA-DRB1等位基因会影响肠道微生物群。AS微生物群中肠道变化的重复试验结果与HLA分子与肠道微生物群相互作用导致疾病的疾病模型一致。有多种模型阐释其发生机制，包括：HLA- B27有利于更具炎症性的肠道微生物群发挥作用；HLA-B27携带者肠道粘膜侵袭性的增加和/或HLA-B27携带者对细菌的异常免疫反应。相似的假设可以解释HLA-DRB1在驱动RA免疫发病中的作用。无论这些模型中哪一个是正确的，这里提供的数据表明该领域需要进一步研究，包括对肠道微生物群的操作是否可能是治疗性的，或者是否有可能预防高危人群的AS或RA。
评论
文章支持这一观点：因为遗传效应，AS或RA患者HLA等位基因（HLA-DRB1、HLA-B27）发生改变，该改变影响到肠道微生物群落，导致生理失调，诱发肠道疾病。由于某些尚待阐明的机制，改变的群落微生物和HLA等位基因互相作用，最终导致AS、RA疾病的发生。对于机制的进一步阐明，是将来的研究重点。
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