编译：yl，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
在非酒精性脂肪肝病（NAFLD）患者中一直有循环甘氨酸降低的报道，但关于甘氨酸降低的原因，其作为致病因素的作用，及其治疗潜力仍不清楚。最近，研究人员对患有NAFLD的人类和小鼠进行了转录组学研究，发现甘氨酸生物合成基因，主要是丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶1（AGXT1）受到抑制。遗传（Agxt1-/-小鼠）和限制甘氨酸供应的饮食方法导致饮食诱导的高脂血症和脂肪性肝炎加重。线粒体/过氧化物酶体脂肪酸β-氧化（FAO）受抑制和炎症增强也是潜在原因。研究人员使用了具有降脂/降糖双重特性的甘氨酸类化合物作为非酒精性脂肪肝的潜在疗法，并发现了一种三肽（Gly-Gly-L-Leu，DT-109），它可以在高脂肪、胆固醇和果糖饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）小鼠模型中，改善身体成分，降低循环葡萄糖、血脂、转氨酶、促炎细胞因子和脂肪性肝炎。
研究人员应用元基因组学、转录组学和代谢组学来探索其潜在机制。Clostridium sensu stricto在NASH小鼠中明显增加，DT-109治疗后减少。DT-109诱导肝脏FAO途径，降低脂毒性，刺激新生谷胱甘肽合成。反过来，DT-109通过抑制NF-κB靶基因和TGFβ/SMAD信号转导，减弱炎症浸润和肝纤维化。与其对肠道微生物组的影响不同，DT-109刺激FAO和谷胱甘肽的合成与NASH无关。总之，甘氨酸代谢受损可能导致非酒精性脂肪肝。以甘氨酸为基础的治疗通过刺激肝脏FAO和谷胱甘肽的合成来减轻实验性NAFLD，因此值得未来进行临床评估。
原名：Glycine-based treatment ameliorates NAFLD by modulating fatty acid oxidation, glutathione synthesis, and the gut microbiome
译名：以甘氨酸为基础的治疗通过调节脂肪酸氧化、谷胱甘肽合成和肠道微生物群来改善非酒精性脂肪肝
期刊：Science Translational Medicine
IF：16.304
发表时间：2020.12
通讯作者：Oren Rom
作者单位：密歇根大学
随着代谢组学和肠道微生物组学的进展，人们对NAFLD发病机理的认识不断提高，提出了新的治疗靶点。人们已经认识到NAFLD患者脂类和糖类代谢异常。基于代谢组学的最新研究表明，特定氨基酸的代谢失调在NAFLD发病机理中发挥作用，特别是甘氨酸。NAFLD中大多数循环氨基酸的含量增加，但甘氨酸浓度却降低了，并且与肝脂肪变性（HS）、肝细胞膨胀和小叶炎症呈负相关。最近将低血浆甘氨酸与已知的生物标志物一起用于预测NASH。此外，低浓度的循环甘氨酸与肥胖症、二型糖尿病（T2D）、代谢综合征（MetS）、冠心病和心肌梗死等NAFLD合并症的高患病率有关，而高浓度的甘氨酸则与肥胖有关。非必需氨基酸甘氨酸是由几种前体在肝脏中合成的。这些反应被关键酶催化，这些酶驱动丝氨酸（丝氨酸羟甲基转移酶，SHMTs）、苏氨酸（苏氨酸脱氢酶，TDH）、肌氨酸胆碱（胆碱脱氢酶和肌氨酸脱氢酶，SARDH）和丙氨酸合成乙醛酸（AGXTs）来形成甘氨酸。甘氨酸用于多种途径来产生必需分子，包括嘌呤、谷胱甘肽（GSH）、血红素和肌酸。流行病学证据将低水平循环甘氨酸与心脏代谢疾病性关联，人类或啮齿动物模型中的研究报告了甘氨酸给药的降糖/降脂、保护肝脏或抗炎作用。然而，尚未采用完全模拟人类疾病和准确剂量的模型对甘氨酸在NAFLD中的作用进行全面研究。考虑到NAFLD现有治疗方法缺乏，而循环甘氨酸降低与NAFLD严重程度相关这一现象，使其可能成为一种与新的有效的治疗方法。在目前的研究中，我们的目标是通过对患有NAFLD的人和小鼠的肝脏进行转录组学，以及通过遗传和饮食方法限制小鼠的甘氨酸供应，来研究甘氨酸代谢改变是否有助于NAFLD的发展，并进一步探讨了基于甘氨酸的化合物作为NAFLD的潜在疗法及其作用机理。
1 人和鼠NAFLD中甘氨酸生物合成受损
为了测试甘氨酸代谢改变是否有助于NAFLD的发展，我们首先研究了西方饮食（WD）诱导形成HS的C57BL/6J小鼠。经过12周WD饮食，高胆固醇血症（图1 A）和HS，经苏木精伊红（H&E）和油红O（ORO）染色证实，肝脏甘油三酯（TGs）和总胆固醇（TC）明显定量（图1B至D）。靶向代谢组学显示，在所有氨基酸中，血浆甘氨酸降低最显著（P=0.0111），而其前体丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸升高（图1 E），显示甘氨酸生物合成受损。患有HS的小鼠肝脏中关键的甘氨酸生物合成基因被下调，其中Agxt1抑制最显著（P=0.0002；图1 F）。此外，棕榈酸（PA）诱导的TG积累后，HepG2细胞中的AGXT1明显下调（图1 G和H）。为了评估在更严重的NAFLD中是否存在类似的模式，我们对24周高脂、高胆固醇、高果糖NASH饮食诱导的晚期NASH和纤维化小鼠的肝脏进行了RNA测序（图1 I）。调节氨基酸生物合成的途径，特别是甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和乙醛酸的代谢，在NASH中受到抑制，包括Agxt1的下调（P=0.0009；图1 J）。利用饮食诱导的NASH小鼠的独立队列，我们通过定量聚合酶链式反应（qPCR；图1 K）证实了Agxt1的抑制。为了说明晚期NAFLD患者的甘氨酸生物合成基因是否同样受到抑制，我们基于NASH患者肝脏的转录组学进行了meta分析。发现NASH患者的AGXT1以及AGXT2显著下调，而催化甘氨酸降解为乙醛酸的D-氨基酸氧化酶（DAO）表达上调（β=0.216，P=0.0025；图1L）。在来自肝移植供者（28例）的样本中，我们发现AGXT1的表达与肝脏脂肪含量呈负相关（r=−0.196，P=0.0049；图1M）。
图1 NAFLD中甘氨酸生物合成受损。持续12周给C57BL / 6J小鼠喂食标准食物（CD）或西方饮食（WD）：（A）血浆TC。（B）肝组织学。（C）TGs。（D）TC。（E）相对于CD的血浆氨基酸。（F）相对于甘油醛3-磷酸脱氢酶（Gapdh）的甘氨酸生物合成基因的肝脏表达。（G）细胞TGs。（H）200 mM PA或乙醇（EtOH）作用24h后HepG2细胞中AGXT1的表达。（I）肝形态学，H＆E和Sirius Red组织学。（J）通过CD或NASH饮食喂养的小鼠肝脏RNA测序显著下调甘氨酸生物合成基因/途径（蓝色）。（K）饮食诱导NASH小鼠Agxt1相对GAPDH的表达。（L）通过对健康和NASH患者的肝脏数据进行meta分析，甘氨酸代谢基因显著下调（蓝色）或上调（红色）。（M）移植供者肝脏AGXT1表达与肝脏脂肪含量的Spearman相关分析（n=206）。2 AGXT1缺失加剧饮食诱导的高脂血症和NASH为了研究AGXT1在HS中的潜在作用，我们首先使用小干扰RNA（siRNA）使HepG2细胞中的AGXT1沉默，从而增强了PA诱导的TG积累（图2 A至C）。相反，AGXT1的过表达降低了细胞的TGs（图2 D和E）。为了研究AGXT1在体内丢失的影响，我们使用CRISPR-CAS9（图2 F）建立了Agxt1−/−小鼠。Western blot证实Agxt1−/−小鼠的肝脏中没有AGXT1（图2 G），较低的甘氨酸/草酸血浆比例证实酶活性受损（图2 H）。在标准饲料（CD）中，Agxt1−/−小鼠的肝脏组织学与之前指出的Agxt1+/+小鼠相似，我们还发现血浆肝酶和FAO、炎症或纤维化基因的肝脏表达也是相似的。然而，在NASH饮食12周后，Agxt1−/−小鼠的血浆TGs、TC、AST和丙氨酸转氨酶（ALT）升高（图2 I至L）。肉眼可见Agxt1−/−小鼠的腹膜腔较大，肝脏黄色增强（图3 A）。尽管体重没有显著差异，但肝脏重量增加（图3 B），并且与Agxt1−/−小鼠的HS和纤维化增强有关（图3 A，C和D）。H＆E和Sirius Red染色的组织学分析证实，Agxt1−/−小鼠的NAFLD活性评分（NAS）和纤维化评分更高。为了了解Agxt1−/−小鼠中饮食加速诱发NASH的潜在机制，我们对Agxt1+/+和Agxt1−/−小鼠的肝脏进行了测序，然后进行了qPCR验证。通路分析显示，Agxt1−/−小鼠的能量代谢和FAO通路受到抑制，促炎通路上调（图3G），调节过氧化物酶体和线粒体FAO的基因表达下调（图3 H至J），而编码促炎性信号传导、细胞因子、纤维生成和细胞外基质（ECM）重塑的调节基因则被上调（图3 H，K和L）。因此，肝特异性甘氨酸生物合成酶AGXT1在NAFLD中受到抑制，其缺乏会加速饮食引起的NASH。甘氨酸缺乏会加剧饮食引起的高脂血症，高血糖症和HS。
图2 NASH饮食的Agxt1−/−小鼠的血浆变化。用靶向AGXT1（siAGXT1）或非靶向siRNA对照（siCTL）的siRNA转染HepG2细胞：（A）相对于GAPDH的AGXT1 mRNA；（B）相对于GAPDH的AGXT1的Westernblot和定量密度测定；（C）细胞TGS。用带有GFP标签的AGXT1质粒或GFP质粒转染HepG2细胞：（D）AGXT1相对GAPDH的Western blot。（E）细胞TGS。（F）CRISPR-Cas9构建Agxt1−/−小鼠。（G）Western blot证实不存在AGXT1。（H）甘氨酸/草酸比值（n=8）、（I）TGS、（J）TC、（K）AST和（L）ALT（n=12）。
图3 Agxt1−/−加速小鼠饮食引起的NASH。（A）腹腔的总体外观和肝脏组织学，（B）肝脏重量/体重比，（C）肝脏TG，（D）肝脏TC，（E） NAS，（F）纤维化评分。（G） Agxt1+/+和Agxt1−/−小鼠肝脏RNA测序后的通路分析。（H）NASH相关DEGs的热图。通过qPCR确认（K）与炎症相关和（L）与纤维化相关的DEGs。3 DT-109：一种具有降糖降脂双重性质的甘氨酸三肽考虑到上述发现，以及大量证据表明循环中较低的甘氨酸与血脂异常，以及糖尿病前期和T2D有关，我们推断甘氨酸化合物可能通过降糖降脂双重作用而具有治疗潜力。因此，我们搜索了在结构上与甘氨酸相似的化合物，并选择了10个代表甘氨酸支架的结构、构象、静电或等量构型修饰的化合物，其中4种适合口服（半数致死剂量>1 mg/g）。长期补充甘氨酸（1 mg/g/d）可降低Apoe−/−小鼠的循环TGs，恢复糖耐量，加速肥胖C57BL/6小鼠的脂肪流失。在人类中，同时摄入甘氨酸和葡萄糖可使血糖升高的幅度降低50%以上。为了测试降糖效果，我们对给予甘氨酸或甘氨酸化合物（0.5 mg/g）的C57BL/6J小鼠进行了口服葡萄糖耐量试验（OGTTS）。没有一种被测试的化合物比甘氨酸更能有效地降低血糖的升高。另一种能降低小鼠血糖的氨基酸是亮氨酸。研究表明，甘氨酸和亮氨酸（Gly-Gly-L-Leu）结合的三肽DT-109具有显著的降糖作用。我们对DT-109及其D-异构体（Gly-Gly-D-Leu，DT-110）进行了OGTT试验。结果表明DT-110的降糖作用与甘氨酸相似，而DT-109是唯一一种比甘氨酸更有效的降糖化合物。4 DT-109改善身体成分，预防饮食引起的NASH为了进一步探索DT-109对NASH的治疗潜力，我们设计了一种实验方法来模拟晚期NAFLD（图4 A）。与饲喂CD的小鼠相比，饲喂NASH饮食小鼠的循环葡萄糖、TC、AST和ALT升高。对部分小鼠进行安乐死，证实NASH饮食喂养后肝脏重量增加。组织学分析显示HS、肝细胞膨胀、炎性细胞浸润和早期纤维化。确认NASH后，将其余小鼠随机分为两组，每天分别口服0.125 mg/g或0.50 mg/g的DT-109，或等量的亮氨酸、甘氨酸或水，以灌服CD+H2O的小鼠为对照（图4 A）。在第18周，OGTT和非空腹血糖测量证实了DT-109（0.5 mg/g/d）最有效的降糖作用。身体成分分析显示，与CD组相比，NASH饮食中所有组的体重均增加（图4 B）。与喂食NASH饮食和服用水的小鼠相比， DT-109（0.5 mg/g/d）治疗的小鼠显示出体内脂肪减少，瘦肉得以保留（图4 C和D），并且EAT和SAT脂肪细胞肥大减少，食物摄入无明显差异。饮食引起的肥胖的代谢反应涉及向脂肪和低碳水化合物利用的转变，这反映了RER的降低。CLAMS分析显示，所有接受NASH饮食的组中RER均降低，但在用DT-109（0.5 mg/g/d）治疗的小鼠中，未发现明显差异。能量消耗或活动没有显著差异。终点时，甘氨酸或DT-109抑制了喂食NASH的小鼠血浆AST、ALT和碱性磷酸酶（ALP）的增加（图4E至G）。在用甘氨酸或DT-109处理的小鼠中血浆TGs降低（图4 H），而通过DT-109（0.5 mg/g/d；图4 I）的小鼠仅降低TC。因此，用甘氨酸或DT-109处理可显著减轻NASH饮食诱导的严重肝肿大，而亮氨酸处理则不会（图4 J和K），并且DT-109可显著降低NAS（图4 L）。
图4 DT-109可以防止饮食引起的NASH。（A）以CD或NASH饮食喂养C57BL / 6J小鼠12周。确认NASH后，小鼠随机接受DT-109（0.125或0.5 mg/g/d）或等量的亮氨酸、甘氨酸（0.17，0.33 mg/g/d）或水，持续12周。（B）体重，（C）脂肪（％），（D）瘦体重（％）。终点血浆分析：（E）AST，（F）ALT，（G）ALP，（H）TG，（I）TC。（J）大体形态和H＆E组织学。（K）LW / BW比。（L）NAS。为了探索基于甘氨酸治疗NASH的潜在机制，我们应用了几种方法，包括元基因组学、转录组学和代谢组学。为了研究以甘氨酸为基础的NASH治疗对肠道微生物群的反应，我们利用16S核糖体DNA（rDNA）测序技术分析了治疗前、治疗2周和10周后的粪便微生物区系（图4 A）。主成分分析（PCA）和操作分类单元（OTUs）的等级聚类显示了NASH小鼠在治疗前具有不同的微生物组成。线性判别分析（LDA）的效应大小（LEfSe）显示，揭示了门水平的变化，包括NASH中Proteobacteria的增加，以及CD中Actinobacteria和Tenericutes的增加。在目水平上，Clostridiales在NASH中的数量显著增加，而属水平上，Clostridium sensu stricto的丰度增加了10倍。2周后，治疗组之间出现微小差异。然而，10周后，喂食NASH并服用水或亮氨酸的小鼠的肠道微生物群与甘氨酸或DT-109小鼠的肠道微生物群显著分离（图5 A和B）。Clostridium sensu stricto在NASH中的比例仍然过高，但处理后的小鼠没有这些差异，而Alistipes和Oscillibacter在CD中的表达过高（图5 C）。为了确定与NASH严重程度相关的细菌，我们接下来评估了不同属与NAFLD相关参数之间的相关性。Oscillibacte、Alistipes和Pseudoflavonifractor与NAS、肝脏重量呈负相关，Clostridium sensu stricto与NAFLD相关参数均呈显著正相关（P<0.01；图5D）。在用DT-109治疗或在用CD喂养的小鼠中，Clostridium sensu stricto的相对丰度降低了（图5 E），而Alistipes的相对丰度却提高了（图5 F）。为了测试不同的微生物组成是否是由DT109处理直接造成的，我们接下来测试了DT-109对正常小鼠肠道微生物群的影响。给C57BL / 6J小鼠喂食相同的CD，并用DT-109或水处理10周。正如NASH饮食中发现的，DT-109显著降低CD上的非空腹血糖，血浆TGs和TC（P <0.05；图5 G至I），最终，DT-109处理的小鼠的肠道微生物群与水处理的小鼠分开聚类（图5 J）。对OTUs和LEfSe的分析表明，DT-109处理的小鼠在门水平上Firmicutes减少，Bacteroidetes增加（图5 K）。第8周DT-109组Clostridium sensu stricto的相对丰度降低，但对Alistipes、Pseudoflavonifractor和Oscillibacter没有明显影响（图5 L和M）。这些发现表明，在NASH饮食上观察到的不同微生物组不太可能是DT-109的直接作用的结果，并导致我们进一步探索了基于甘氨酸的疗法预防NASH的机制。
图5 DT-109对饲喂NASH小鼠或对照小鼠肠道微生物群的影响。（A）PCA，（B）各组中OTUs的等级聚类，（C）各组过表达菌群的LDA，（D）显著差异的属与NAFLD相关参数之间的相关性。（E） Clostridiumsensu stricto。（F）治疗前（12周）、治疗2周和10周后各组粪便样本中的Alistipes。（G）终点非空腹血糖、（H）血浆甘油三酯和（I）总胆固醇。在开始和DT-109治疗2、6、8和10周后采集粪便样本：（J）终点PCA，（K）门水平比较，（L）Clostridium sensustricto，（M）整个研究过程中来自各组的粪便样本的Alistipes。6 DT-109逆转了NASH饮食引起的转录组改变，FAO受损和肝脂毒性为了进一步探索潜在的机制，我们收集的肝脏进行了RNA测序。PCA揭示，亮氨酸处理过的NASH饮食小鼠的基因表达谱与水相一致，而甘氨酸和DT-109（0.125 mg/g/d）饲喂处于基因表达谱的中间，DT-109 （0.5 mg/g/d）与CD饲喂更接近（图6 A）。火山图显示，相比于CD，灌胃水或亮氨酸的NASH饮食处理小鼠差异表达基因（DEGs）发生了重大变化，而甘氨酸或DT-109处理可显著减少差异表达基因（图6 B）。NASH饮食组的水对照组与DT-109组（0.5 mg/g/d）进行比较，DT-109的通路分析模式与CD相似，表明DT-109逆转了NASH饮食诱导的潜在通路的改变（图6 C）。对与NASH发病的主要方面有关的基因的分析（图6 D）显示，调控FAO的关键基因在CD中过表达，而在灌胃水或亮氨酸的NASH小鼠中，这种作用受到抑制。qPCR分析证实，与 NASH饮食小鼠水对照组相比，灌胃甘氨酸或DT-109均显著上调了Ppargc1a和Acot3/Acot4的表达，而Acsl1、Acaa2、Acadm/Acadl、Hadha、Eci1/Eci2和Acox1只被DT-109上调（0.5 mg/g/d；图6E）。Western blot分析显示，饲喂NASH的小鼠经水或亮氨酸处理后，羟酰辅酶A脱氢酶α（HADHA）和乙酰辅酶A酰基转移酶2（ACAA2）的活性显著降低，而甘氨酸或DT-109处理的小鼠则无明显变化。与NASH小鼠水对照组相比，DT-109（0.5 mg/g/d）处理的小鼠ACAA2显著增加（图6F）。因此，用甘氨酸或DT-109处理降低了H2O或亮氨酸处理的NASH小鼠肝脏中标记的HS（图6，G至H）。尤其是已知能促进NASH的二酰甘油（DAG）被DT-109显著降低（0.5mg/g/d；P=0.0120；图6I）。为了验证FAO相关基因的上调是否是由DT-109处理直接引起的，我们评估了DT-109处理10周的小鼠肝脏中的基因表达和脂质谱。与NASH饮食的小鼠的研究结果相似，DT-109可以降低CD小鼠的肝脏TGs（图6 J和K），并使调节FAO的基因上调（图6 J和K）。海马实验支持RNA测序、qPCR和Western印迹分析，显示DT-109处理HepG2细胞24小时后，耗氧率（OCR）增加，而用肉碱棕榈酰基转移酶1A（CPT1A）抑制剂etomoxir阻断FAO可减弱这一作用（图6 L）。因此，以甘氨酸为基础的治疗诱导FAO，减少了NASH饮食诱导的HS和脂毒性。
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