编译：茗溪，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
土壤中与植物相关的微生物群落很大程度上受到水分有效性的影响。在水稻等被淹作物中，水管理对微生物动力学的影响还没有得到充分了解。
本研究将意大利北部最高产地区之一的试验田中生长的水稻作为研究对象，并对其微生物群进行了全面研究。通过对16S、ITS和18S rRNA基因扩增子的454焦磷酸测序，研究了旱地管理 (非淹水、好氧) 和传统管理 (传统淹水、厌氧) 等2种不同水分管理方式下水稻土壤和根系的微生物群。
结果表明，土壤水分状况对微生物群落的形成起主要作用，而物候阶段的影响较小。原核生物和真菌群落（包括Firmicutes、Methanobacteria、Chloroflexi、Sordariomycetes、Dothideomycetes和Glomeromycotina）在水分管理中的丰度显著变化。在传统和旱地管理之间观察到植物有益微生物、腐生和致病性微生物的分布。
此外，本研究还通过网络分析证明了传统和旱地管理条件之间不同的共丰度动态对微生物中心(紧密相连的微生物) 有重大影响，在没有洪水的情况下完全转变为好氧微生物。
原名：Water management and phenology influence the root-associated rice field microbiota
译名：水分管理和物候对根系相关的稻田微生物群有影响
期刊：FEMS Microbiology Ecology
IF：3.675
发表时间：2020.7.28
通讯作者：Erica Lumini
作者单位：意大利可持续植物保护研究所（IPSP）、国家科学研究委员会（CNP）
图S1 实验流程图
图S2现场选址及抽样方案
1. 微生物多样性和群落结构：淹水与未淹水水稻根系和土壤
在3个植物物候阶段 (S1-S3)，水淹(传统管理) 和未水淹 (旱地管理) 农田收集水稻的根和土壤并对其进行焦磷酸测序，完成了4个文库的测序（2个原核生物16S rRNA基因扩增文库和2个真菌ITS文库），每个文库分别获得了152,963和77,489条原始reads。经过质量过滤和去除嵌合体后，利用QIIME将reads聚类到1,656(16S rRNA)和139 (ITS2) 个OTUs。稀疏曲线和Good's 分析表明，几乎每个样本在每个目标范围内，多样性占主导地位，而考虑到不同的样本量，将OTU丰度标准化到中位测序深度。用Chao1 (丰富度) 和Shannon (多样性) 指数测定原核生物的Alpha多样性，结果显示，与水稻根系相比，土壤中原核生物的丰富度和多样性显著提高 (图1A)。有趣的是，根据这2个指标，在取样的任何物候阶段，根和土壤中的细菌和古细菌多样性都没有受到水分管理的影响。相反，ITS数据集在土壤和根体现了相似的Alpha多样性，只有在旱地管理S2和S3阶段的Shannon多样性显著更高(图1C) 。
图1 水稻土壤和水稻微生物多样性的研究。在3个物候阶段 (S1-S3) 对传统管理 (完全淹水) 和旱地管理 (半淹水) 的根进行管理。16S (A) 和ITS2(C) 数据集展现土壤和根系分区的Chao1和Shannon多样性指数。字母表示不同平均数之间的差异，根据方差分析后的Tukey's post-hoc 比较 (P < 0.05)。(B, D) 原核生物和真菌中基于Bray-curtis相似性的旱地和传统管理水稻根系和土壤样品的PCoA图。原核生物群落 (图1B) 和真菌群落(图1D) 的主坐标分析显示，2个不同菌落在不同的位置显著聚集 (PERMANOVA，P < 0.001)。同样，在根系和土壤中，2种水分管理条件下的样品（真菌和原核生物）也显著分离(PERMANOVA, P < 0.001) 。PCoA图强调，在土壤中，传统管理和旱地的样本比根系样本更接近，这表明根系的水分管理效应被放大了。物候阶段仅对真菌有显著影响(P < 0.01)，而对原核生物均无影响。在根和土壤间以及在旱地和传统管理处理之间，细菌和古生菌群落在门水平上的相对丰度体现出很大差异 (图2A)。在土壤和根中，Proteobacteria和Chloroflexi占优势。然而，在每个水平中均存在高度代表性的菌种。在土壤中， Acidobacteria、Nitrospirae和Thaumarchaeota (后者只存在于土壤中) 也占优势，而根中Actinobacteria 则表现出较高的丰度。有趣的是，PCoA也表明旱地水分管理强烈地影响着群落的聚集，且对根系的影响大于对土壤的影响。特别是在旱地条件下，随着Firmicutes的降低，Chloroflexi和Actinobacteria在根中的丰度更高，而在土壤中，通过对相对丰度值的浅分析，在门水平上的水分管理没有发现重大变化。
图2 土壤和根的微生物群落组成。在3个物候阶段 (S1-S3) 对传统管理 (完全淹水)和旱地管理 (半淹水) 的根进行管理。优势原核生物门 (A) 和真菌类 (B) 的平均相对丰度。为了进一步了解旱地管理和传统管理原核生物群落的功能作用，绘制了FAPROTAX功能分类图。分析结果显示，在979条记录中，至少有266条记录(27.17%)反映了不同功能模式对田间水分状况的响应，其中根的群落存在较大差异，其在传统管理条件下以产甲烷和依赖硫的代谢为主。根和土壤的真菌群落均以 Ascomycota 为主。然而，它们在根中的总体相对丰度 (91.8%)大于土壤中的总体相对丰度(68.5%)。在土壤中观察到Zygomycota(15.5%) 较多，而Basidiomycota的丰度在根和土壤中相似，分别为3.9%和6.1%。在门水平上，旱地管理并没有改变其相对丰度，但在纲水平上发现了重要的重排现象(图2)。根和土壤中最丰富的纲以 Dothideomycetes、Sordariomycetes和Leotiomycetes为代表。在根中和传统管理条件下，Sordariomycetes在根中占主导地位 (81.3%)，但在旱地条件下，随着Dothideomycetes迅速升高（从8.7%到57.2%），Sordariomycetes的数量显著下降 (23.6%) (图2)。同样，在传统管理和旱地管理的条件下，Leotiomycetes已经从1.6%上升到7%。相比之下，土壤真菌群落在各处理中更为稳定，只有Sordariomcetes从传统管理的26.2%增加到旱地管理的42.9%。本研究利用FUNGuild工具探索了真菌OTUs的生态策略。即使仍然有35%的OTUs未鉴定，但能在已鉴定的65% OTUs中检测到所有3种主要营养模式和11个群体。当移除未鉴定的OTUs时，未定义的腐生生物是最具代表性的群体，第2大类OTU包括植物病原体。在水稻根系中，在S1 (分蘖期) 和S2 (穗形成期) 的旱地条件下，OTUs的致病性模式显著增加。但在相同条件下，只有S1处植物病原群落中含有较高的OTUs数量。虽然土壤中病原菌没未发生变化，但在旱地条件下，腐生生物(在营养模式和群落类别中) 显著减少。而在根中该腐生生物并没有发生变化。总的来说，这些结果表明，水管理(未淹水和淹水) 在根中比在土壤中发挥的作用更大，并在影响水稻微生物群落的组成方面起着至关重要的作用。为了进一步了解旱地和传统管理条件下的群落变化，我们对土壤和根的分区进行了差异丰度分析。即使在2种样品中有大部分的OTU被水管理因子显著影响 (FDR <0.05) ，但根中向旱地管理富集种群的数量 (log2fold-change>0) 均高于衰竭型原核生物和真菌 (log2fold-change<0) (图3A和B)。而在土壤中向旱地管理富集种群的数量与根中的比例相反(图3A和B)。同样，在原核生物中，根与土壤间差异较大的OTUs的重叠程度有限，而在真菌中较大 (图3C和D)。
图3 原核生物(16S)和真菌(ITS2)传统管理和旱地管理管理差异丰度分析。对16S (A) 和ITS2 (B) 使用MA图可视化数据集的根和土壤中富集/损耗OTUs。显著富集的OTUs为蓝色，分离的OTUs为红色，x轴是log10。(C, D) Venn图显示原核生物和真菌在根和土壤中富集/衰竭OTUs的重叠。在16S (E) 和ITS2(F) 数据集中，根和土壤的点图显示了不同的丰富的属在旱地和传统管理的差异。原核生物的圆点颜色代表门，真菌的圆点颜色代表类。网点大小与OTU丰度成log2比例。为了更详细的了解由水管理引起的微生物动力学，本研究进一步关注通过分类学鉴定到1个已知属的富集/衰竭的OTU。旱地管理水分管理导致根系中放线菌的丰度增加，其中包括Streptomyces、Haliangium、Phytohabitans和Lentzea (图3E)。其中，Streptomycesdeccanensis (JF439614) 不仅是最为丰富的OTU，也是5个隶属于Roseiflexus高度丰富的OTUs中最丰富的分类群之一。相对丰度图中可以看出Firmicutes在旱地条件下所剩无几，其中包括5个属于Clostridiales的OTUs，特别是Clostridium。同样，在旱地管理条件下，产甲烷菌属 (Euryarchaeota)也高度枯竭，包括 Methanobacterium (3个OTUs)和Methanosarcina (1个OTU)。根与土壤间很少有差异较大的OTUs共享。与根类似，土壤在旱地条件下产甲烷的OTUs也被耗尽 (Methanobacterium，2 OTUs；Methonosarcina，2 OTUs；Methanosaeta， 1 OTU)。Sphingomonas、Anaerolinea、Roseiflexus和Clostridium也与根有相似的差异丰度模式。在旱地管理下全部消失的其他类群在土壤中有很高的代表性，包括Desulfobacca，Pseudomonas，Rhodanobacter和Crenothrix。在富/贫真菌类群中，Dothideomycetes (18 OTUs)、Sordariomycetes (26 OTUs)和Leotiomycetes (9OTUs) 均在土壤和根中丰度较高 (图3F)。常富集的OTUs有Phoma、Fusarium、Gibberella和Penicillium。其他类群，如Colletotrichum，Setophoma和Phaeosphaeria在根中富集。在旱地管理条件下耗尽的OTUs (即在传统管理条件下富集的OTUs) 包括一些土壤和根中共有的属，如Emericellopsis、Pseudeurotium、Tetracladium、Massarina和Madurella。但是，一些OTU是只存在于根或土壤中的。根中Apodus明显减少，而土壤中Tanatephorus，Mrakia和其他一些丰度较低的属减少。对不同有代表性的类群的分析突出了微生物群落对根系和土壤旱地管理的特定响应，而在真菌中体现了土壤和根系间较高的相似性。3. 网络拓扑结构和微生物中心的变化是由田间水管理驱动的
考虑到水资源管理是微生物群落变化的主要来源，我们通过传统和旱地管理的网络分析评估了OTUs之间的关系，包括跨界交互作用。使用SPIEC-EASI估计过滤后的一组频繁出现的OTUs，生成了4个网络 (每个单元2个) (图4)。在所有条件下，未发现未连接的节点，50% 的边均为正相关。与根系相比，随着节点 (OTUs) 和边 (连接) 数量的增加，土壤具有更大的多样性和更高的网络密度。传统管理和旱地管理条件下，每个节点(度) 的平均边数分别为8.93条和7.64条，而根系的平均边数分别为5.22条和5.76条。而将平均节点度归一化到总节点数时，间隔间的值越近，根的值越高。实际上，平均聚类系数(传递性，相邻顶点被连接的概率) 在根中也显著更高。平均路径长度 (网络中从/到每个节点的最短路径的平均长度) 显著缩短 (P < 0.001) 旱地条件下的根系 (3.65) 和传统管理条件下的根系 (3.83)，而相反的模式则是旱地土壤(3.45) 高于传统管理土壤 (3.32)。
图4 共同丰度网络图显示了水稻土壤和根系间和内部相互作用。在传统管理(A) 和旱地管理 (B) 条件下根系微生物相互作用图。传统管理(C) 和旱地管理 (D) 条件下水稻土微生物相互作用图。微生物中心颜色代表不同的分类，在门的水平上，高度集中的中心用文本标签注释。节点大小与程度成正比，边缘透明度表示相关强度。在比较旱地管理和传统管理时，识别最具影响力节点的网络中心性指标突出了根系和土壤的不同模式。在根系中，我们发现，与传统管理条件相比，旱地管理条件下交叉每个节点的最短路径比例是显著降低的，而从给定节点访问其他节点所需的步骤更高。且衡量网络中节点影响的平均特征中心性参数，在传统管理势下一直较高，根系差异较大(传统管理= 0.41，旱地管理= 0.12，P < 0.001)。这表明，在旱地管理下，微生物网络的连接显著增强，但特征中心性描述符的减少表明，微生物网络的边缘横跨不同的OTUs，外围连接少数高度中心的OTUs。单独考虑原核生物和真菌OTUs的网络中心性指标也进行了分析，并与整个群落图进行了比较。有趣的是，我们观察到，除了少数例外，旱地和传统管理网络节点中心性指标的差异在原核生物和真菌中是一致的。为了理解菌群结构如何变动，我们使用核心指标来定义微生物中心，即影响整个网络的高度集中和相互连接的OTU。OTU在密度中心和中心点的离群值被定义为中心（图4）。随着土壤多样性的提高，其微生物中心也越来越丰富（土壤中均值为53.5，根部均值为26.5）。土壤中的旱地管理严重影响了中心的数量，从传统管理的59个减少到旱地的37个。在根部，我们也观察到了微生物中心的减少，但差异要小得多（从21到19）。有趣的是，中心OTU在不同的样品和管理中有很大的不同，并不存在4个条件下都通用的微生物中心（图5）。结果强调，在土壤和根室中，由水管理驱动的微生物中心的变化是不同的。但是也发现了一些共同点，比如Methanobacterial中心仅在传统管理条件下出现，而Roseiflexus中心的动态在2种管理方式下相当。
图5 不同水分管理和样品微生物中心的分类丰度和重叠。真菌和原核生物在根(A)和土壤(B)中中心OTUs的丰度(门水平上)。(C) 显示不同条件下微生物中心重叠的UpSet图；中心矩阵显示了至少有1个OTU的每个可能的集合，上条图显示了每个中心OTU的数量；左面水平条形图概括了不同条件下OTU的总数量：棕色，旱地管理；绿色，传统管理。利用形态学方法监测了水稻各处理和各物候期(S1-S3) 根中AM定植的程度。显微镜分析显示，在传统管理取样的水稻植株中没有AM定植。而在旱地条件下，AM定植较好，在植物生长过程中，丛枝和细胞内菌丝数量增加。由于在低海拔地区的根系中没有发现AMF结构，因此只在土壤中研究了AMF的群落组成。使用AMADF/AMDGR引物对制备了一个18S文库，并进行焦测序，得到161,774个原始reads和34个AMF OTU。稀疏曲线清楚地表明，测序深度充分描述了AMF的多样性。Chao1和Shannon指数在传统管理条件下多样性均有所下降，S2期和S3期差异较大 (图6B)。这在很大程度上与AM对根的定殖分析中出现的模式一致。PCoA轴将来自旱地管理和传统管理的AMF群落很好地区分开 (图6C)，而且PERMANOVA分析也显示了水管理的显著效果(P <0.001)。至于细菌群落，物候阶段不构成AMF群落变异的来源(P>0.05)。
图6 旱涝管理下不同植物生长阶段水稻土AMF群落的多样性与组合 (A) AMF OTUs在属水平上的相对丰度 (B) Chao1和Shannon多样性指数。字母表示经方差分析和Tukey’s post-hoc检验后均值之间的差异 (P < 0.05)。(C) 基于Bray-Curtis相似性的PCoA图，括号中显示了每个轴所解释的方差。(D) 传统与旱地管理的MA图显示了富集(蓝色) 和衰竭 (红色) OTU。(E) 点图显示每一代AMFOTU差异丰富。土壤中检测到的AMF OTUs属6个属：Glomus(66.2%)、Claroideoglomus (17.3%)、Diversispora (10.1%)、Paraglomus (3.1%)、Archaespora (3.1%)和Acaulospora (0.1%)(图6A)，对应18个不同的虚拟类群 (MaarijAM数据库)。100%土壤样品的核OTUs由Glomus(VTX00143)和Funneliformis caledonium (原名Glomus caledonium，VTX00065) 为代表。差异丰度分析表明，水分管理对AM不同属的丰度有较大影响。在已鉴定的34个OTUs中，有1个在旱地处理中已耗尽(log2fold-change<0) ，而有17个在其富集 (log2fold-change<0;图6D)。富集与枯竭OTUs的优势与多样性指数的变化密切相关，Diversispora OTUs (VTX00054) 已耗尽，而Claroideoglomus (5 OTUs)、Glomus (7 OTUs)、Archaeospora (4 OTUs)和Paraglomus (1 OTU, VTX00281) 均富集 (图6E)。
水的有效性对农业生态系统中的微生物群落有着重要的影响，也深刻地影响着与生态位（土壤或根）无关的复合体。已有与气候变化相关的研究证实了不可预测的事件如极端洪水可干扰微生物群落。本研究通过研究不同淹水条件下、不同物候阶段的水稻根系相关微生物和土壤微生物，证实了不同的水分管理导致了根系和土壤微生物群的组成和结构变化的假设。本研究表明水稻土是微生物多样性的蓄水池，证实了水分管理的影响是有限的。然而，在针对根系的旱地管理时，其一方面导致功能替代固氮细菌的变化，并刺激AMF和链霉菌Streptomyces的增殖，这在之前的其他环境和控制条件下已经证实，另一方面干扰了Methonobacterial中心，促进了真菌病原体的出现。改变这种平衡涉及到农学利益：互惠共生微生物实际上可能为植物提供生理上可获得的营养物质和植物激素，从而促进植物生长，并可能抑制植物病原体，同时增加植物对热、盐和干旱的抗逆性。
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