科研 | J. Exp. Med.：幽门螺旋杆菌作用C型凝集素受体导致胃炎恶化
编译：微科盟午忧茶，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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实验设计
实验结果
1. Mincle是幽门螺旋杆菌的免疫刺激性脂质成分
为了检测幽门螺旋杆菌中的免疫刺激脂质成分，本研究分离了幽门螺旋杆菌中亲脂性提取物，通过高效薄层色谱（HPTLC;图1 A）将其分成16个部分，并评估了每个部分刺激树突状细胞（DC）的能力。我们在馏分13-14部分中发现了独特斑点（Rf = 0.83，氯仿/甲醇/水[65：25：4，vol / vol / vol]）的峰值，峰值所对应的活性诱导DC产生炎症细胞因子（如TNF）。这种活性独立于TLR接头MyD88，但敲除CARD9或FcRγ后活性完全消失（图1 B），这表明FcRγ-CARD9偶联的免疫受体（包括CLR）参与配体识别和信号传导。因此，我们在NFAT-GFP反应细胞与FcRγ结合表达了几种CLR，并发现13-14部分活化的细胞表达巨噬细胞诱导型C型凝集素（Mincle; Clec4e）和FcRγ（图1C和D）、巨噬细胞C型凝集素（MCL; Clec4d）。MCL与Mincle可形成异二聚体并稳定其在细胞表面的表达，因此，我们设计了Mincle-CD3ζ和MCL-CD3ζ嵌合体，并证实Mincle是一种识别13-14部分的受体(图1E)，与其激活MyD88/细胞的能力一致(图1B)，该片段不具有TLR2/4配体活性(图1A)。由13-14部分诱导的肿瘤坏死因子在小细胞缺乏的骨髓CD细胞中缺失(图1F-H)，证明了这种树突状细胞在13-14部分成分的识别中具有重要作用。我们通过用乙酸铜-磷酸(脂质染色，图1F)和orcinol（图1G）染色来显现馏分13-14部分，表明该级分含有糖脂。
2．鉴定αCAG为一种Mincle配体
我们采用HPTLC(图1I)鉴定了αCAG的分子成分，并且使用表达Mincle的细胞(图1J)和Mincle-Fc结合蛋白(图1K)来验证其剂量依赖性活性，同时用质谱和核磁共振光谱确定其化学结构。高分辨率电喷雾电离飞行时间质谱显示了一个与分子相关的离子峰atm/z781.5979 [M + Na]+(图1L)，表明αCAG可能是一种胆固醇酰基吡喃糖苷。我们对αCAG的活性组分进行甲醇裂解后，再通过气相色谱-质谱分析，鉴定三种饱和脂肪酸甲酯(FAMEs14:0, 16:0, 18:0;图S1 B)。通过甲醇裂解后δ3，5-胆固醇的检测证实了部分胆固醇的存在(图1B和C)。
馏分13-14部分的1H-NMR谱显示胆固醇、α-吡喃葡萄糖苷和饱和脂肪酸的特征信号(图1M和N)。此外，2D-核磁共振分析如1H-1H相关光谱、全相关光谱、异核单量子相干(HSQC)和异核多键相关(HMBC)光谱，证实馏分13-14部分中的主要化学部分为αCAG (图1 D)。综上所述，这些结果表明主要的配体成分是固醇基-6-氧-十四酰基-α-吡喃葡萄糖苷(αCAG，C14:0；图1N)，并且其结构包含刚性和平面的四环支架，不同于以前报道的带有柔性脂尾的Mincle配体。
幽门螺旋杆菌从宿主中摄取胆固醇，并利用其葡萄糖基转移酶Hp0421在39位添加葡萄糖，这是合成αCAG的关键一步，我们从缺乏hp0421基因（幽门螺旋杆菌Δhp0421）的幽门螺旋杆菌菌株中提取脂质成分。幽门螺旋杆菌Δhp0421中没有与αCAG对应的HPTLC频带，且等效部分未能激活Mincle细胞（图1O）和BMDC（图1P），因此，我们鉴定αCAG为幽门螺旋杆菌的一种重要脂质，且与Mincle相互作用。
3．αCAG的免疫刺激特性
为了证实馏分13-14部分的活性不是由少量污染物引起的，我们化学合成了αCAG，并鉴定出αCAG合成样本激活Mincle的能力与高效配体海藻糖6，6-甲油酸酯（TDM）相当（图2A)。而αCAG的生物合成前体——胆固醇α-葡萄糖苷(αCG)不具有这种活性。我们通过用Mincle-Ig融合蛋白探测板证实了合成的αCAG与Mincle的直接结合(图2B)。在DC中，合成的αCAG诱导炎性细胞因子的分泌(图2C)、上调共刺激分子(图2D)和诱导2型一氧化氮合酶穿过Mincle(NOS2图2E)。此外，与TDM的比较表明，αCAG是人类衍生的最有效的Mincle配体（图2F），αCAG有效激活了人类单核细胞衍生的DC（hMoDC）以产生促炎性细胞因子IL-8（图2G）。
因此，我们分析了αCAG对DC-修饰的T细胞的影响。在存在及不存在人工合成的αCAG的不同情况下，我们用卵清蛋白脉冲的骨髓间充质干细胞培养来自卵清蛋白特异性TCR转基因小鼠的T细胞。在αCAG的存在下，干扰素-γ和白细胞介素-17的抗原特异性增加(图2H)。为了评估小鼠体内T细胞的启动，我们用全卵清蛋白和αCAG免疫小鼠后，检测其回忆反应；再次刺激WT小鼠的T细胞后检测到IFN-γ，而Mincle-和FcRγ缺陷小鼠的IFN-γ水平较低(图2I)，因此，αCAG-Mincle-FCRγ轴通过激活APC促进抗原特异性T细胞启动。
4．Mincle对幽门螺旋杆菌诱导的病理生理贡献胃炎
我们采用了慢性幽门螺旋杆菌感染模型评估αCAG-Mincle相互作用的病理生理学作用。WT和Clec4e-/-小鼠感染了幽门螺旋杆菌SS1 6周后，在胃LNs和派尔氏斑分离的T细胞中检测到幽门螺旋杆菌特异性回忆反应。当Clec4e-/-小鼠被感染时，其T细胞产生的干扰素-γ和IL17水平要低得多(图3A和B)。然而，Clec4e-/-和WT小鼠胃中的细菌数量相近(图3 C)，这表明幽门螺旋杆菌特异性Th1/17细胞反应不能有效地根除细菌。小鼠感染幽门螺旋杆菌后，出现慢性胃炎，然而我们通过组织学分析评估在Clec4e-/-小鼠中胃炎严重程度得到改善(图3D)。在受感染Clec4e-/-小鼠胃匀浆中中性粒细胞和巨噬细胞数量的增加受到抑制(图3E，图2A和B)。胃组织的转录组分析显示，在Clec4e-/-小鼠中的炎症基因表达显著降低(图3F)，进一步证实在没有Mincle的情况下慢性胃炎得到减轻。通过宏基因组分析评估，由于WT和Clec4e-/-小鼠胃微生物群的差异，这种作用不太可能出现(图2C)。总的来说，这些结果表明Mincle有助于减轻幽门螺旋杆菌诱发的胃炎，抗体(Ab)阻断Mincle导致抑制T细胞反应(图3G-I；图2D)病和慢性胃炎(图3J，图2E)而不增加幽门螺旋杆菌的数量(图3K)。
图3 Mincle在幽门螺旋杆菌引起的胃炎中的作用
（A、B）WT或Clec4e-/-小鼠在2 d内口服3×108CFU幽门螺杆菌3次。感染后6周，用指定浓度幽门螺旋杆菌刺激胃上皮细胞或派尔斑细胞，未感染的WT小鼠用作对照，通过ELISA测定上清液中IFN-γ（左图）和IL-17（右图）的浓度；（C）幽门螺杆菌感染后8周从WT和Clec4e-/-小鼠的胃中回收的细菌数；（D）未感染和感染组胃切片抗CD3和F4 80的苏木精-伊红染色和免疫组化染色；（E）感染后第6周，小鼠胃MNC中Ly6G + CD11b +或F4 / 80 + CD11b +细胞的数量；（F）基于RNA序列分析的差异表达基因的热图；（J）感染6周后分析胃MNC中Ly6G + CD11b +细胞的数量；（K）被幽门螺旋杆菌感染的小鼠胃中细菌CFU通过选择性琼脂平板计数菌落数。
5．非靶向脂质组学揭示幽门螺旋杆菌代谢产物的炎症转化
在厌氧条件下，胃中的幽门杆菌会转变成休眠的球状形式。正如先前的研究表明，球状形式具有更强的免疫刺激活性，厌氧培养条件下，我们在体外重现了这种转化（图4A）。我们使用液相色谱与TOFMS联用，对螺旋形和球状形式幽门螺旋杆菌的提取物进行脂质组分析。非靶向脂质组学显示，尽管胆固醇酯种类基本不变（图3A和B），但螺旋/类球体转化明显改变了脂质组成，特别是对于含胆固醇的脂质（图4B）。 TLC分析还证实了脂质组成的变化，最显着的变化是αCAG的带移（图4C，黑色箭头）和球状新生成脂质的出现（图4C，灰色箭头）。对αCAG分子组成的分析表明，作为螺旋形式、痕量成分的较长脂肪酸在球状形式中相对更丰富（图4D和图3C），而相应的短链肉豆蔻酸酯(C14:0)αCAG以球状形式减少。因此，我们合成了含有不同脂肪酸的αCAG，脂肪酸种类如肉豆蔻酸酯（C14：0）、棕榈酸酯（C16：0）和硬脂酸酯（C18：0）等，发现αCAG的活性随着其脂肪酰基链的延长而增加，同时，我们通过产生的炎性细胞因子（图4E和G）及表达的Mincle评估了αCAG的活性（图4H）。
如上所述，通过球果糖醇染色观察到的极性糖脂——斑点C的量以类球体形式显着增加（图4C，斑点C）。当用斑点C刺激腹腔巨噬细胞时，我们以CARD9依赖的方式检测到IL-6的产生(图4I)。由于斑点C不被Mincle识别，我们测试了几种受体并鉴定了DC免疫激活受体(DCAR；Clec4b1图4J)，选择了一种FcRγ偶联的CLR作为候选受体，已知DCAR在分枝杆菌中识别酰化磷脂酰肌醇甘露糖苷(ACPIMs)，然而，幽门螺旋杆菌不具有AcPIM物种的能力，DCAR必须识别一个幽门螺旋杆菌可识别的配体，使用四极杆轨道阱质谱（图4K、4L、4A、4B），然后通过气相色谱-质谱、核磁共振光谱分析进行甲醇裂解（图4M、4N、4E），斑点C被鉴定为胆固醇磷脂酰α-葡萄糖苷(αCPG；图4N)。以α环磷酸鸟苷为靶点的脂质组学数据显示，在薄层色谱上观察到的球状α环磷酸鸟苷的相对量显著增加(图4C)，而其脂肪酸组成没有变化(图4O，图3D)。αCPG在结构上与已知的DCAR配体AcPIM截然不同，只是两者都含磷酸盐的磷脂基。因此，我们合成了αCPG和αCPG类似物，它们缺乏磷酸酯部分，胆固醇酰胺连接的α-葡萄糖苷（图4F）。合成的αCPG通过DCAR发出信号，但不是酰胺类似物（图4P），表明磷酸盐是αCAG中不存在的DCAR结合关键结构。
图4 非靶向脂质组学表明幽门螺旋杆菌通过改变脂质组成来调节免疫刺激
（A）幽门螺旋杆菌螺旋形和类球体形的扫描电子显微照片；（B）从螺旋形和类球体形的幽门螺旋杆菌中分离出的胆固醇脂的质量(m/zof前体离子)对液相色谱保留时间的2D图，前体离子图谱鉴定为胆固醇酯（CE），αCG，αCAG，αCPG和溶血αCPG（仅以球状形式检测）；（C）幽门螺旋杆菌的螺旋形或类球体形式的脂质提取物，黑色箭头表示αCAG，灰色箭头表示脂质成分；（D）在图3中分析的αCAG的每个脂肪酸片段离子的峰面积。用αCG，αCAG C14：0，C16：0或C18：0（0.02、0.06、0.2、0.6和2 nmol /孔）刺激S3 C.（EG）BMDC 1d。用ELISA法测定上清液中TNF（E），MIP-2（F）和IL-6（G）的浓度；（H）用αCG，αCAG C14：0，C16：0刺激表达Mincle +FcRγ的细胞或C18：0（0.016、0.08、0.4和2 nmol /孔）持续20 h并分析GFP表达；（I）用αCAGC14：0，Spot C（0.02、0.2和2 nmol /孔）或LPS刺激来自WT或Card9-/-小鼠的腹膜分泌液。通过ELISA定量IL-6的表达；（J）用HPTLC分离的类脂刺激表达TLR2或TLR4的单独表达FcRγ，Mincle +FcRγ或DCAR +FcRγ或HEK的NF-κB的报告细胞，幽门螺杆菌培养20 h并分析GFP或SEAP表达；（K）在正离子模式下，斑点C（上图）的全扫描MS光谱和m / z 1208.9006 [M + NH4]的MS / MS光谱；（L）斑点C的全扫描MS光谱和m / z1189的MS / MS光谱；（M）斑点C的1 H-NMR谱图；（N）斑点C的化学结构和1 H-NMR化学位移分配；（O）αCPG的每个脂肪酸片段离子的峰面积分析（P）用纯化的αCPG，合成的αCPG（C14：0 19c：0）或αCPG酰胺类似物（0.1、0.3和1 nmol /孔）刺激表达DCAR +FcRγ的报告细胞20小时并分析GFP表达。
6. 幽门螺旋杆菌损伤中αCAG/αCPG的耗竭对其毒力的影响
为评估αCAG/αCPG对宿主抗幽门螺旋杆菌反应的作用，我们研究了突变幽门螺旋杆菌的免疫刺激活性。幽门螺旋杆菌胆固醇葡萄糖基转移酶(幽门螺旋杆菌HP0421)，不能产生αCAG和αCPG。结果表明这些胆固醇葡糖苷在其突变株的螺旋和球状形式中不表达 (图5A)，而骨髓间充质干细胞表面CD80的表达上调 (图5B)。我们将正常菌株WT、突变菌株HP0421与抗原模型树突状细胞、OT-II T细胞共培养，进一步评估突变菌株HP0421的T细胞启动潜力。与菌株WT相比，菌株HP0421中的OT-II T细胞分泌的干扰素-γ和白细胞介素-17的抗原依赖性显著降低 (图5C和5D)。细胞因子分泌的减少与我们使用FcRγ缺陷的骨髓细胞时检测到的抑制相似，其中的Mincle和DCAR无功能(图5C和5D)。然而，在加入人工合成的αCAG到菌株HP0421后，细胞因子的产生得以恢复，表明αCAG是幽门螺旋杆菌T细胞启动的主要成分之一。
最后，我们讨论了胆固醇葡萄糖苷在幽门螺旋杆菌诱发性胃炎中的作用。与感染幽门螺旋杆菌的小鼠相比，幽门螺旋杆菌HP0421感染的小鼠的胃炎明显改善，并且我们通过粘膜中的炎性细胞的浸润来进行评估胃炎的改善情况(图5G和5H)，但是胃中的细菌数量没有显著改变(图5I)。同样，我们在幽门螺旋杆菌感染时检测到大量的抗幽门螺旋杆菌抗体 (图5J和5K)。这些结果表明，幽门螺旋杆菌通过产生胆固醇葡萄糖苷αCAG和αCPG提高毒力促进胃炎的发生与发展。
讨论
在目前的研究中，我们提供了第一个由细菌病原体产生的脂源性毒力因子先天免疫识别的例子，然而，这些免疫反应并不能有效地清除幽门螺旋杆菌。
除了已经确定的Th1的作用外，最近的研究均表明了Th17在幽门螺旋杆菌感染期间对胃炎的诱导和发展有重要作用。在本研究中，幽门螺旋杆菌脂质增强了Th1和Th17的表达，与报道的CLR信号特征一致。据报道，另一个T细胞亚群——天然杀伤T（iNKT）细胞，可被胆固醇苷激活，但本研究中我们没有观察到αCAG和α-CPG可激活iNKT细胞（图S2F）；或者，αCAG和α-CPG通过巨噬细胞/DC衍生的IL-12以TCR非依赖的方式激活iNKT细胞，但幽门螺旋杆菌感染后，幽门螺旋杆菌细胞与Jα18缺陷18−/−小鼠的表型无显著差异（图S2G和H），这表明在目前的SS1模型中，iNKT细胞在针对幽门螺杆菌的免疫应答中起到有限的作用。
一些细菌和真菌产生的非甾醇基脂肪族配体具有灵活的尾部结构，并且可以通过Mincle发出信号。幽门螺旋杆菌衍生的Mincle配体在其结构和识别模式上是非典型的，而诱发胃炎是幽门螺旋杆菌特有的病理学特征。在胃淋巴组织慢性感染期间，类固醇基配体对APCs的持续启动可能有效地诱导致病性T细胞表达，并且最有可能的是这些反应发生在偏中性的环境中，而不是酸性环境，特别是发生在继发性淋巴样器官中。目前研究表明，一些树突状细胞在幽门螺旋杆菌感染的患者机体中被激活，并能诱导Th1反应。
αCAG是人类最有效的Mincle配体，尽管人类缺乏DCAR直系同源物，但α-CPG仍能有效激活CD细胞，表明α-CPG也可能通过其他受体在人体中发挥作用。我们最近关于小鼠DCAR-配体复合物结构的报告将有助于人源配体的鉴定。总的来说，这些结果暗示研究者们可通过降低αCAG和α-CPG水平来预防人类胃炎。虽然在我们的研究中，幽门螺旋杆菌Δhp0421突变体没有表现出明显的生长劣势，但在其他幽门螺杆菌临床菌株中该酶失活会导致菌株生长受损，这为幽门螺旋杆菌感染后的治疗提供了一个有潜力的治疗靶点。
αCAG和α-CPG是幽门螺旋杆菌所特有的，尽管幽门螺旋杆菌中胆固醇糖基化的生理优势仍有待研究，有些研究已经报道了αCAG对该细菌的一些有益作用，但α-CPG的功能在细菌和宿主中都没有得到证实。有人提出，由幽门螺杆菌引起的类固醇糖基化和酰基化可能会分解对细菌本身有害的环境类固醇。
另一方面，宿主对这些代谢物的识别保护，意味着这些代谢物的相互作用可能会给宿主带来其他益处，尽管有时我们不能在幽门螺旋杆菌感染的情况下观察到它们。鉴于Mincle对分枝杆菌的感染起着保护作用，我们认为它可能对宿主有一种生存优势。在“慢性炎症”和“保护性免疫”之间的平衡下提供选择压力，在进化过程中可能改变CLR家族的产生。事实上，哺乳动物物种的一些CLR成员因基因复制而丢失或因基因复制而产生。
非靶向脂质组学可以鉴定幽门螺旋杆菌中的胆固醇脂类。除了上述“二酰基”αCPG外，我们还检测到球形的CPGC19c：0（lyso-αCPG），但其生物学功能尚不清楚。我们还鉴定了胆固醇甘油磷酸糖苷和胆固醇乙醇胺磷酸糖苷，这些都是免疫调节代谢物的潜在靶点。
临床研究表明，低浓度的维生素D与严重的胃炎有关，服用维生素D可减轻幽门螺杆旋菌感染，减缓胃炎的发展；但其分子作用机制尚不清楚。维生素D3是一种被幽门螺杆菌有效吸收的3β-OH类固醇，可作为Hp0421的竞争性抑制剂。抑制这种酶的维生素D衍生物的开发可能为预防幽门螺杆菌引起的胃炎和随后的恶性肿瘤提供一种有前景的方案。
抗生素根除幽门螺杆菌是预防幽门螺杆菌引起的胃炎的一种治疗方法。然而，由于耐药性和微生物失调的出现，抗生素的作用效果受到了限制。此外，抗生素治疗不彻底会诱导球形体，从而增加了胃炎的风险，因此，以Hp0421为靶点或以其固有免疫受体为靶点，可能可以为目前的抗生素治疗提供一种补充方法。幽门螺旋杆菌特异性辅助性T细胞也与造血疾病的病理生理学有关，如粘液相关淋巴组织淋巴瘤和特发性血小板减少性紫癜。因此，识别一些细菌佐剂及其宿主衍生的脂质受体，通过它们激活T细胞，减缓疾病的发生与发展，这对临床治疗具有重要意义。