科研│RICE：水稻感染稻瘟病lncRNA的响应机制（国人佳作）
编译：夕夕，编辑：景行、江舜尧。
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长链非编码RNA（lncRNA）在植物的许多生理过程中起到重要的调控作用。使用高通量测序技术，鉴定到许多与病原体相关的植物中的lncRNA，其中部分lncRNA与植物防御有关。稻瘟病菌引起的稻瘟病是影响水稻生长的疾病之一。然而目前还没有关于水稻患稻瘟病后lncRNA的调控作用的研究。作者研究了与水稻稻瘟病有关的lncRNA。水稻感染稻瘟病菌之后，共鉴定到83个上调的lncRNA和78个下调的lncRNA。部分lncRNA的表达模式与宿主基因的表达模式类似，表明这些lncRNA在调节基因转录水平中具有顺式调控作用。差异表达的lncRNA和基因共表达分析显示，部分lncRNA与病原体抗性有关的基因有关。GO分析显示，这些基因与萜类生物合成和防御等功能显著富集。有趣的是，稻瘟病菌感染后水稻的茉莉酸（JA）水平显著增加。JA可以调节水稻稻瘟病抗性，作者认为lncRNA可能参与JA介导水稻对稻瘟病的抗性。本研究鉴定到了水稻稻瘟病响应的lncRNA，为调节水稻和稻瘟病相互作用提供有价值的信息。
论文ID
原名：Long Non-coding RNAs Responsive to Blast Fungus Infection in Rice
译名：水稻感染稻瘟病lncRNA的响应机制
期刊：Rice
IF：3.912
发表时间：2020年11月
通讯作者：瞿绍洪
通讯作者单位：浙江省农业科学院
DOI号：10.1186/s12284-020-00437-w
实验设计
结果
1 lncRNA测序
作者取稻瘟病菌感染水稻和对照组的三个时间点的样本进行lncRNA测序，每个处理设置三个生物学重复。对raw data进行过滤并与水稻参考基因组进行比对，比对效率在95%以上。随后进行转录本组装和表达水平分析。PCA分析可以将处理组和对照组明显区分，表明稻瘟病菌感染后，水稻lncRNA的表达水平发生了显著变化（图1a-c）。共得到4787个转录本，其中有2366个lincRNA，2184个NATs和237个lncRNA（图1d）。对处理组和对照组进行差异分析，共得到1670个差异表达基因和161个差异表达lncRNA，其中有一个lincRNA在所有差异分组中均上调表达，其余lncRNA在不同处理下表达水平不同（图1e）。在稻瘟病菌感染后，有一半lncRNA上调表达，其余下调表达（图1f）。为验证lncRNA测序数据的可靠性，选择了6个差异表达lncRNA进行qRT-PCR。在处理组 vs 对照组，有两个lincRNA（TY13913和TU29105）表达量上调（图2a和2b）。稻瘟病菌处理72小时后，有两个lncRNA（TU40741和TU7759）上调表达（图2c和2d）。TU41192是一种真菌诱导的NAT，在稻瘟病菌处理72小时后表达水平达到最高（图2e）。qRT-PCR和lncRNA测序结果类似。
图1. 稻瘟病菌感染水稻后lncRNA。a-c.对照组和处理组样本PCA分析，a.24h，b.48h，c.72h。d.鉴定到的lncRNA的总数，lincRNA：基因间区lncRNA，NAT：天然反义转录物。e.差异表达lncRNA的韦恩图。f.上调和下调lncRNA的数量
图2. 对lncRNA进行qRT-PCR。a-b.lincRNA。c-d.lncRNA。e-f.NAT。
2 差异表达lncRNA在水稻-稻瘟病菌相互作用的功能
随后作者研究差异表达lncRNA在水稻-稻瘟病菌相互作用的功能。首先，部分lncRNA在调控转录机制和启动子区域的染色体修饰中起到顺式元件的作用。例如，lncRNA COOLAIR和COLDAIR来源于拟南芥FLC基因反义和内含子区域。这两个lncRNA直接参与Polycomb响应复合物2的相互作用，从而抑制FLC的转录。拟南芥中lincRNA ELENA1可以参与介导19a亚基相互作用，在病原体感染后激活PR1表达。为了预测病原菌诱导的lncRNA是否具有顺式作用，作者将比较了差异表达的lncRNA和附近基因的表达水平。首先鉴定了NAT靶基因和lncRNA及lincRNA的附近基因。筛选差异倍数大于2的基因，共鉴定到34个lncRNA-基因（图3a，3b和3c）。大部分lncRNA及其基因的表达模式类似。例如，NAT TU3643在稻瘟病菌处理后下调表达，其靶基因RZFP34也下调表达（图2f和3a）。已有研究表明RZF34可以调节水稻的气孔开放程度。许多植物病原菌会通过气孔进入宿主，表明TU3643-RZFP34可能参与水稻-稻瘟病菌的相互作用。NAT TU41192和靶基因SAG12在真菌处理后均上调表达（图2e和3a）。SAG12负调控会诱导细胞死亡，可能在抗稻瘟病菌中发挥作用。谷胱甘肽S-转移酶基因（GSTU4）在植物抗氧化胁迫中起到重要作用。不同处理下lncRNA TU7759和靶基因GSTU4的表达模式相似（图3b）。有趣的是，稻瘟病菌处理后LOX-RLL和lncRNA TU40741均上调表达。
图3. 病原菌响应相关的lncRNA及其靶基因和邻近基因的表达模式。a.NAT。b.lncRNA。c.靶基因。
3 WGCNA分析
为探索差异表达lncRNA和差异表达基因之间的关系，作者进行了WGCNA分析。共鉴定到7个模块（图4a），每个模块用不同颜色表示。其中绿色模块的基因数量最多，有1270个模块成员。作者设置阈值为0.4，选择203个编码基因和35个lncRNA构建共表达网络（图4b）。为了鉴定那些基因与lncRNA有关，进行了GO富集分析。作者发现与防御反应和萜类代谢过程有关的功能显著富集（图4c）。萜类化合物与水稻对稻瘟病的抗性有关。选择与病原菌抗性相关基因的网络中（图4d）。结果表明，差异表达lncRNA可能在水稻与稻瘟病菌相互作用中起到重要作用。
图4. 共表达分析和lncRNA相关基因的GO富集分析。a.差异表达lncRNA和差异表达基因的WGCNA分析。b.绿色模块中基因的网络。c.GO富集分析。d.4个差异表达lncRNA和已知病原菌抗性相关基因之间的相关性网络图。
对黄色模块进行网络分析，发现TU40741与LOX-RLL基因共表达（图5a）。LOX-RLL与AOS和AOC催化茉莉酸前体OPDA。qRT-PCR分析表明，稻瘟病菌处理后LOX-RLL表达水平增加（图5b）。序列分析表明，TU40741来源于LOX-RLL的第二个内含子（图5c）。已有研究表明JA信号转导通路调节水稻对稻瘟病菌的抗性。鉴定稻瘟病菌感染后LOX-RLL的产物水平，稻瘟病菌处理48h和72h后OPDA的水平显著升高（图5d）。与之前的研究结果一致，茉莉酸水平没有明显差别（图5e）。茉莉酸的下游产物活性JA-llA和JA-Val的含量增加（图5f和5g）。萜类化合物在水稻中起到抗菌的作用。水稻对稻瘟病菌的抗性涉及单萜和二萜类化合物。这些化合物的生物合成受到JA信号调节。LOX-RLL是水稻稻瘟病菌诱导基因。LOX-RLL也称herbivore-induced LOX（HI-LOX）。沉默水稻中HI-LOX会降低herbivore-induced的JA水平，使得草食动物更易咀嚼植物。结果表明LOX-RLL在生物胁迫中诱导JA信号的作用。这些结果表明，LOX-RLL介导JA生物合成可能在稻瘟病菌抗性中起到重要作用。一些内含子lncRNA可以调节靶基因的表达。因此，作者认为TU40741可能调控LOX-RLL的表达，进而介导JA信号通路。越来越多的结果表明，lncRNA与病原体诱导的JA生物合成有关。在水稻中，lncRNA ALEX1激活JA通路并增加植物对病原菌的抗性。需要进一步研究来阐明LOX-RLL和TU40741在水稻对稻瘟病菌抗性中的作用。
结论
总的来说，作者对稻瘟病菌感染和正常水稻进行lncRNA测序。通过共表达分析鉴定到一些与病原菌抗性有关的lncRNA。值得注意的是，lncRNA与病原菌诱导的JA信号通路有关。作者的研究结果为水稻与稻瘟病菌的相互作用和调控机制提供了有价值的信息。
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