综述 | GUT：胃肠道癌症中的非编码RNA：从癌症标志到临床应用
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摘要：在过去的几十年里，分子肿瘤学中最意想不到的发现之一，是通过不编码蛋白质的转录物，即非编码rna，识别出一个新的蛋白质编码基因调控层。它们代表了一类异质的转录物，与许多类型的遗传元件相互作用，包括调控DNA、编码和其他非编码转录物，并直接与蛋白质相互作用。在恶性环境中，最终的结果是对任何癌症特征的调节。非编码RNA是最丰富的一类激素，对细胞间的通讯有重要作用，揭示了肿瘤细胞、肿瘤微环境细胞和免疫细胞之间复杂的相互作用。因此，分析它们在体液中的丰度成为生物标志物鉴定的主流。非编码RNA的治疗靶向性是目前正在开发的临床医生的新选择。本文综述了目前研究最多的三类非编码RNAs、microRNAs、长非编码RNAs和环状RNAs的生物学和翻译价值。作者还将关注一些新概念，这些概念有助于开发与非编码rna相关的临床应用，包括使用pyknons发现新的非编码rna，靶向在肿瘤细胞中特异性表达的人类特异性转录物，利用非编码RNA提高免疫治疗的效率。
论文ID
原名：Non-coding RNAs in GI cancers: from cancer hallmarks to clinical utility.
译名：胃肠道癌症中的非编码RNA：从癌症标志到临床应用
期刊：GUT
IF：17.943
发表时间：2019.12.14
通讯作者：George Adrian Calin
通讯作者单位：德克萨斯大学安德森癌症中心，休斯顿，美国
DOI号：10.1136/gutjnl-2019-318279
结果
非编码RNA的癌症标志：
目前研究最多的ncRNAs是microRNAs（miRNAs）、长非编码RNAs（lncRNAs）和环状RNAs（circRNAs）。miRNAs是短的ncRNAs（19-24nt），是从具有独特干环结构的较长转录物中提取的。在功能上，大多数miRNAs与信使rna相互作用，并诱导其靶基因的转录后抑制34（图1A）。lncRNAs可以控制染色质修饰、染色体循环、DNA转录、编辑和稳定影响其翻译的MRNA或直接与蛋白质和其他RNA物种相互作用（图1B）。circRNAs是一种环状RNA转录物，由简单的“反向剪接”过程产生，通过这种过程，线性RNA的3'和5'被连接起来，形成共价不间断的环。circRNAs的功能几乎没有被破译，只有有限的几个角色被描述：miRNA应答（通过不完全互补的直接相互作用）、与蛋白质相互作用和抑制/激活其功能、翻译成蛋白质以及pre-mRNA自身的“后剪接”，这与成熟mRNA的形成（图1C）。
表1中，作者详细介绍了所选miRNAs、lncRNAs或circRNAs的靶点和机制。
维持增殖信号
逃避生长抑制
通过体外敲除H19，细胞周期被阻断，增殖受到抑制。H19调节CDK4和CCND1的基因表达，影响肝癌中Rb1.24的磷酸化，circRNA，circ-ZEB1.33过度表达，海绵miR-200a-3p，去压负责Rb磷酸化的蛋白CDK6，使细胞周期进展。
PDAC中最常见的突变之一是K-Ras的激活，然而细胞可以通过激活衰老来抑制癌基因的永生。整个过程受miR-137控制，miR-137被K-ras突变激活。miR-137以KDM4A为靶点，通过激活衰老，从而激活抑制肿瘤转化的肿瘤抑制网络（包括p53和Rb）。在GC中，lncRNA BC032469过度表达，高水平与晚期和较短生存期相关。这种lncRNA通过刺激miR-1207-5p间接导致人类端粒酶逆转录酶（hTERT，端粒酶的催化元件）的过度表达，从而实现永生。此外，在CRC中，circRNA，circ_上调，通过刺激miR-138，阻断其功能。miR-138靶向两种重要的癌基因，hTERT和程序性死亡配体1（PD-L1），因此，这种环rna的上调间接地诱导了细胞活性的提高，而且很可能也是免疫逃避。
Dietrich等人发现miR-622是KRAS的调节因子，观察到miR-622在肝癌中下调，KRAS上调。此外，他们还观察到，通过在对索拉非尼耐药的肝癌细胞中过度表达miR-622或抑制KRAS，细胞通过激活凋亡被重新定位到药物上。熊等人观察到，在肝癌中，常规化疗上调了在肝癌（HULC）中高度上调的lncRNA的表达，诱导保护性自噬。从机制上讲，HULC通过上调蛋白质沉默信息调节因子1（Sirt1）直接诱导自噬。HULC通过阻断靶向USP22的3个miRNAs（miR-6825-5p、miR-6845-5p和miR-6886-3p）激活泛素特异性肽酶22（USP22）抑制Sirt1的降解。因此，ncRNA网络似乎通过激活肝癌细胞自噬来调节化疗耐药。在PDAC中，circRNA，circ_过度表达，其高水平与肿瘤分期、淋巴结浸润和短期生存有关。功能研究表明，circ_通过降低caspase-3和caspase-9的活性抑制细胞凋亡。
在HCC中，lncRNA H19被证明富含外体，由癌细胞产生并输送到内皮细胞，在那里它诱导了CRC中VEGF和细胞间粘附分子-1.40的增加，Wang等人发现了一种lncRNA，它是大肠腺瘤性息肉病（APC）的下游分子，他们称之为lncRNA-APC1。lncRNA-APC1通过抑制促血管生成因子和外显子的产生抑制血管生成，通过直接作用抑制Rab5b mRNA的表达。最后，在GC中，lncRNA，PVT1通过结合和增加STAT3的磷酸化诱导血管生成，一个已知的转录因子VEGF-a。这一不断扩展的lncRNA在血管生成中发挥调节作用，被Yu和Wang称为“Angio-LncRs”。
体内外转移实验证明GClnc1是一种侵袭调节因子。GClnc1以一种非常复杂的方式发挥其功能，lncRNA是蛋白质的支架，能够结合WDR5和KAT2 a，甲基转移酶和乙酰转移酶复合物的成分，控制多个基因的组蛋白修饰，改变GC的表型。
研究了lncRNA在大肠癌基因组不稳定性中的作用，lncRNA能够在基因组水平上诱导不稳定性并保持稳定性。lncRNA-NORAD基因敲除导致异常有丝分裂，导致染色体不稳定（CIN）。在机制上，NORAD能够结合并分离PUMILIO蛋白，在没有NORAD的情况下，PUMILIO蛋白抑制一组能够维持基因组稳定性的基因。另一方面，lncRNA CCAT2在CRC中诱导CIN。CCAT2在MSS-CRC中高表达，以高水平CIN为特征的肿瘤，在体外和体内（在骨髓恶性肿瘤小鼠的骨髓细胞中）都能诱导CIN。CCAT2在CIN中的确切作用仅部分被描述，CCAT2通过控制MYC的表达来发挥其功能，众所周知的基因组完整性调节器。
促瘤炎症
胃肠道癌，如IBD或幽门螺杆菌性胃炎。miR-301a在IBD和CRC患者结肠组织中高表达。miR-301a基因敲除小鼠对化学性结肠炎具有抵抗力，促炎细胞因子水平降低。同样的基因敲除小鼠在化学CRC模型中出现的肿瘤较少。
在正常胃粘膜中，miR-22在生理上表达良好，但在幽门螺杆菌感染的情况下miR-22下调，下调NLRP3，NLRP3是GC炎症的关键调控因子。
Ye等人描述了lncRNA环氧化酶-2（Cox-2）在巨噬细胞极化中的作用，lncRNA Cox-2在M1中表达良好，在M2巨噬细胞中表达下调。通过敲除M1中的lncRNA Cox-2，这些巨噬细胞的肝癌杀伤功能丧失，增殖、侵袭、迁移和血管生成受到刺激。在M2巨噬细胞中观察到相反的结果，概述了lncRNA Cox-2在抑制促肿瘤炎症中的作用。
失调的细胞能量学
为了了解miRNA在肿瘤代谢中的作用，邱等人发现miR-124-3p通过调节磷酸核糖焦磷酸合成酶1（PRPS1）和核糖-5-磷酸异构酶A（RPIA），一种替代性糖酵解途径戊糖磷酸途径的酶，抑制CRC中乳酸的产生。Redis等发现lncRNA-CCAT2通过控制GLS亚型的表达，是肿瘤代谢的调节因子。高水平的CCAT2诱导谷氨酰胺酶亚型C（GAC）的过度表达，而谷氨酰胺酶肾亚型没有改变。CCAT2与裂解因子I复合蛋白的直接相互作用控制了大肠癌GAC亚型的优先合成。此外，位于CCAT2内的rs6983267单核苷酸多态性（G/T）的G等位基因促进了GAC选择性剪接，部分解释了该等位基因的高CRC风险。65 circRNAs在胃肠道肿瘤代谢中的作用尚未完全被破译，但第一个机制研究开始出现：circMAT2B被上调在肝癌中，高水平与短OS相关。
逃避免疫破坏
在HCC中，lnc-表皮生长因子受体（lnc-EGFR）在调节性T细胞中过度表达，并与体内和临床样本中肿瘤大小的增加直接相关。此外，LNC-EGFR席夫能诱导EGFR的过度表达，抑制IFN-γ的表达，从而抑制细胞毒性T淋巴细胞的活性。lnc-EGFR直接与EGFR结合，抑制受体的泛素化。在HCC中，circRNA circTRIM33-12下调，导致miR-191的表达下调，miR-191在生理上受到抑制。高水平miR-191诱导TET1转录后抑制，降低多种肿瘤抑制因子的水平，包括UL16结合蛋白1（ULBP1）。ULBP1是自然杀伤2型D受体的配体之一，在激活自然杀伤和T细胞中起重要作用。
癌症的一个新的特征是神经发生（肿瘤微环境中的神经生长）和轴突生成（神经末梢生长）。肿瘤细胞分泌神经营养物质。GC的生长受胆碱能信号的促进，胰腺癌（PC）进展由肾上腺素能和感觉神经激活。但被胆碱能神经元抑制和结肠癌，如果被神经高度浸润则被认为更具攻击性。最近的研究表明，肿瘤细胞分泌的外体诱导癌周神经生长，并且已知外体含有ncRNA物种，因此自然假设外体ncRNAs是肿瘤-神经串扰的重要成分。
最后，外体被多种蛋白质包裹，包括主要的组织相容性复合物I和II、整合素、乳糖蛋白、CD9、CD63和CD81，它们在外体向特定靶细胞的传递中起着至关重要的作用。84最近的数据证明外体ncRNAs是由肿瘤细胞分泌的，具有功能性作用（图2A）。同样，HCC肿瘤的秘密外显子体含有miR-103，它下调多个内皮连接蛋白因此，增加肿瘤细胞外渗。体内数据证实miR-103高表达的异种移植物更常转移到肺或肝88（图2B）。
细胞间通讯中的ncRNA: 癌症生物标记物新发现
对于GC，一个研究组提出了一个由5个miRNA组成的小组（miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR-486-5p），用于区分早期GC和健康对照组（AUC=0.890，训练和验证阶段相结合）。前三个miRNA是由GC细胞株分泌的。评估了miRNA在组织和术前及术后血浆中的表达，报道了miR-17-5p、miR-21、miR-106a、miR-106b的上调和let-7c在GC组织和血浆中的下调。对血浆来源的5个lncRNA面板（TINCR、CCAT2、AOC4P、BANCR和LINC00857）进行GC诊断的准确性分析，发现在鉴别GC与健康对照（AUC=0.91）方面优于癌胚抗原（CEA）。在胃癌前病变（AUC=0.82）和胃肠道间质瘤（AUC=0.80）中分离GC也取得了良好的效果。对于大肠癌，由血清miR-21、miR-29a和miR-125b组成的小组能够准确区分早期结直肠肿瘤（低级别上皮内瘤变和高级别上皮内瘤变）和健康对照组（AUC=0.827）；与对照组相比，小肿瘤患者（小于5mm）血清miR-125b和miR-29a显著高表达。101血清miR-203上调被报道为一种预后生物标记物，与预后不良（HR=2.1）和转移风险高相关，尤其是肝（OR=6.2）和腹膜（OR=7.2），并可能有助于风险分层。
对于PC，一个研究组开发了一种高准确度的结合外显子蛋白miRNA诊断工具，用于区分PC患者和健康对照组（敏感性100%，特异性80%）。四miRNA小组（miR-1246、miR-4644、miR-3976和miR-4306）在训练队列中的诊断AUC=0.958，在验证队列中的AUC=0.944。流式细胞术测定的五蛋白组（CD44v6，MET，CD104，EpCAM，T span8）在训练组中的AUC值为0.977，在验证组中的AUC值为0.933。
大样本发现12个差异表达的miRNA（miR-16、miR-218a、miR-220a、miR-224、miR-225、miR-227a、miR-229c、miR-230a-5p、miR-2191、miR-2323-3p、miR-2345和miR-2483.5p），其中他们构建了4个不同的miRNA嵌板，与CA19-9一起用于PC诊断。其中一个小组特别有助于区分早期（I-II）PC和健康对照组（AUC=0.93）。
Konno等人观察到，在早期PC患者的血清中，检测高水平的甲基化miR-17-5p是可能的。
一个研究小组调查了PC患者唾液样本中的lncRNAs，并描述HOTAIR和PVT1能够准确区分PC和胰腺良性肿瘤以及健康对照组（两者比较AUC=0.909），血浆circ-LDLRAD3与CA 19-9联合检测，PC和对照组的AUC分别为0.87。这种环状rna的水平与肿瘤的临床病理特征相关，可作为一种预后指标。
在胃肠道肿瘤中应用ncRNAs作为液体生物标记物的主要局限性与研究人群的选择、体液的选择或技术测量问题（提取、检测、量化和标准化策略）有关。根据体液和ncRNA的转运机制（EV，与蛋白质或脂质结合），不同的提取方法可以导致不同群体和数量的RNA的回收。技术研究，如脑脊液的研究，确定哪种提取方法对胃肠道的每种液体都是最好的。针对这些限制的一个可能的解决方案是使用webtool miRDaR。
Srinivasan等人比较了五种生物流体和不同载体类型（EVs、蛋白质和脂质）的多种提取方法，并评估了提取小RNA用于测序研究的最佳方法。作为这项研究的一部分，作者开发了miRDaR，它详细说明了在给定的生物流体中，哪种方法是给定miRNA/miRNA子集的最佳提取方法。目前大多数关于ncRNA的研究都用作初始筛选方法微阵列，并且数据是通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）得到证实的。在GC中，目前，在一个临床试验中，患者被招募开发miRNA，用于预测化疗反应的mRNA信号（NCT03253107）。在表3中，作者列出了循环生物标记物临床试验，每种主要的胃肠道肿瘤一项。
基于ncRNA的治疗可分为两种主要方法：靶向高表达的致癌ncRNA（ncRNA抑制）或恢复ncRNA，后者在癌症中被下调并发挥肿瘤抑制作用（ncRNA模拟）（图3）。ncRNA抑制疗法可以通过使用隔离内源性ncRNA的抑制剂来实现。124种抗miRNA的ASOs被称为抗miRNA寡核苷酸（AMOs）。
miR-148a模拟物装载到纳米脂质体中，经腹腔注射，每周两次，连续6周，在体内治疗肝癌。miRNA模拟物抑制肿瘤生长，显著减少肝纤维化，是肝癌治疗的一个有前途的工具。miRNAs与toll样受体的直接结合是众所周知的，并且能够激活免疫系统。循环ncRNAs是一种生物标记物，是评价肿瘤内恶性细胞和非恶性细胞之间平衡以及理解不同细胞间相互作用的理想指标。多种证据表明，抑制高表达的癌基因ncRNAs或替换肿瘤抑制性ncRNAs可能成为一种新的癌症治疗策略。ncRNAs似乎是诱导下一个胃肠道肿瘤治疗范式转变的最佳候选，类似于单克隆抗体产生的范式转变。接下来的几年将以ncRNAs治疗的发展为标志，其相关作用，仅次于目前的化疗和单克隆抗体将需要建立。
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