科研 | FRONT PLANT SCI：茶树受到盐胁迫早期lncRNA如何参与调控？（国人作品）
编译：寒江雪，编辑：十九、江舜尧。
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茶树(Camellia Sinensis)是重要的经济作物，因为受到盐胁迫等各种非生物胁迫的严重影响，影响了茶树的广泛种植。然而，对盐胁迫下长链非编码RNA(lncRNA)在转录调控中的作用知之甚少。本研究对盐胁迫和对照条件下的茶树枝条进行了高通量测序，共鉴定出16452个特有 的lncRNA，其中有172个差异表达lncRNA(DE-lncRNA)。GO和KEGG对其顺式和反式靶基因的富集分析结果表明，这些DE-lncRNA在盐胁迫下与转录因子(TF)相互作用，在半乳糖醇合成酶(GOL)、钙信号通路等多种途径中发挥重要作用。
论文ID
原名：Integrated Analysis of Long Non-coding RNAs (lncRNAs) and mRNAs Reveals the Regulatory Role of lncRNAs Associated With Salt Resistance in Camellia sinensis
译名：对长链非编码RNA (Long Non-coding RNA, lncRNA)和mRNA联合分析揭示lncRNA在茶树耐盐性中的调控作用
期刊：Frontiers in Plant Science
IF：4.106
发表时间：2020.3
通讯作者：余有本，杨亚军
通讯作者单位：西北农林科技大学园艺学院
DOI号：10.3389/fpls.2020.00218
实验设计
本研究选择一年生的“平阳特早”茶树扦插苗作为研究对象。为分析茶树对高盐胁迫的早期反应，在茶树开始出现盐胁迫症状并在处理后轻度枯萎的4h随机采集第一叶和第二叶的新鲜叶片样品。对照组和处理组每组三次生物学重复。对所取样本进行转录组测序分析，lncRNA的鉴定，差异分析，顺/反式靶基因及其功能预测。构建lncRNA与mRNA和miRNA的调控网络。
结果
1茶树中lncRNA的鉴定
为了研究茶树对盐的响应，分别对盐处理组和对照组共6个样本的叶片进行测序，数据比对结果见表1。样本的比对率为88.99%~91.10%，通过CPC、CNCI、Pfam和CPAT过滤数据之后共得到16452个候选lncRNA（图1B）。将lncRNA分为四类，分别是11010个lincRNA(66.9%)，2375个反义lncRNA(14.4%)，1863个内含子lncRNA(11.3%)，1204个正义lncRNA(7.3%)（图1C）。根据转录本的长度和外显子的数量将lncRNA与mRNA比较分析二者在结构和序列上的差异。如图2A所示，75.19%的lncRNA<1000个核苷酸，而只有54.28%的mRNA<1000个核苷酸。94.44%的lncRNA有两个外显子(83.15%)或三个外显子(11.29%)，而只有10.05%的mRNA有两个外显子，46.99%的mRNA只有一个外显子(图2B)。
2参与盐胁迫的DE-lncRNA
本研究中鉴定到172个DE-lncRNA，其中有101个上调和71个下调lncRNA（图3）。为了分析这些lncRNA的潜在功能，对DE-IncRNA的上游或下游100 kb预测其顺式靶基因或通过碱基互补配对预测反式靶基因。预测到250个顺式靶基因和421个反式靶基因，并对这些靶基因进行GO和KEGG功能注释。顺式和反式靶基因GO注释发现，细胞组分中注释基因数目最多的功能是“细胞部分”(GO：0005623)，分子功能中“催化活性”(GO：0003824)和生物过程中“代谢过程”(GO：0008152)注释基因数也较多。KEGG注释主要注释到“半乳糖代谢”(Ko00052)、“氨基酸生物合成”(Ko01230)和“核糖体”(Ko03010)等途径（图5A和B）。说明这些途径可能在茶树对盐胁迫的响应中起重要作用。
图3对照和盐处理组中差异表达的lncRNA(DE-lncRNAs)的聚类热图。
图4 A. DE-lncRNA顺式靶基因的GO富集分析。B. DE-lncRNA反式靶基因的GO富集。
图5 A. DE-lncRNAs]顺式靶基因的KEGG富集分析。B. DE-lncRNA反式靶基的KEGG富集分析。
3 DE-lncRNA与mRNA的互作
本研究中，有42个差异表达基因距离DE-lncRNA不到100kb，这些编码基因的注释为生长素反应蛋白(TEA005327.1)、Ca2+转运ATPase 13(TEA027212.1)、液泡膜蛋白KMS1样蛋白(TEA033827.1)等。另外有67个差异表达编码基因预测为23个DE-lncRNA的反式靶基因（图6）。反式靶基因注释为半乳糖醇合成酶(GOL)2(TEA006804.1)、WRKY TF 31 X2亚型(TEA005334.1)、乙烯反应TF ABR1(TEA015017.1)、MYC2 TF(TEA000833.1)等。这些差异表达的mRNA可能与相应的lncRNA相互作用，参与多种途径参与盐胁迫反应的调控。
图6 lncRNA和mRNA之间的相互作用网络。
4盐胁迫下lncRNA参与半乳糖醇合成酶、钙信号通路及与转录因子的相互作用
糖合成和信号转导途径是植物对盐胁迫反应调节网络的关键参与者。如表2所示，除CIPK 23(TEA032544.1)下调外，其余基因均上调。许多TF家族在调节植物在非生物胁迫下的抗性机制中发挥着重要作用。本研究共鉴定了23个DE-lncRNA靶基因为TF，包括HSF、GATA、MADS-box、bHLH、ERF、WRKY、ICE、LHY和MYC。bHLH、LHY和MYC转录因子，GATA和MADS家族中的部分转录因子表达为下调，其余的转录因子表达上调（表3）。
表2半乳糖醇合成酶和钙信号通路中的lncRNA靶基因
表3 lncRNA的靶向转录因子
5 DE-lncRNA与miRNA互作
共有12个lncRNA预测为茶树已知的17个成熟miRNA的靶标对象（表4）。其中四个miRNA，lja-miR7539，csn-miR156h，ath-miR156i和csn-miR156h是多个lncRNA的靶标。有5个lncRNA，MSTRG.56302.5，MSTRG.116911.1，MSTRG.36615.10，MSTRG.55773.2和MSTRG.92784.12，为多个miRNA的靶标。因此推测这些lncRNA和miRNA在盐胁迫下形成了一个复杂的调控网络。
表4 miRNA的lncRNA的假定靶标
6 lncRNA MSTRG.139242.1与其附近的mRNA TEA027212.1相互作用
在DE-lncRNA的所有靶基因中发现一个上调的编码基因TEA027212.1，该基因与上调的lncRNA MSTRG.139242.1距离只有5911bp，编码Ca2+转运ATP酶13。为了验证它们的表达关系，在茶树中利用反义寡核苷酸（AsODN）片段抑制MSTRG.139242.1和TEA027212.1基因表达。qRT-PCR结果显示，抑制lncRNA MSTRG.139242.1后，其表达水平在12-24 h才显著降低，而TEA027212.1的表达水平在0-12 h内显著降低（图7A）。在0到6h 抑制TEA027212.1，MSTRG.139242.1的表达水平在6-12h显著降低（图7B）。这些结果表明，lncRNA MSTRG.139242.1受其附近的编码基因TEA027212.1的调控，参与了茶树对盐胁迫的Ca2+运输。
图7利用AsODN_MSTRG.139242.1和AsODN_TEA027212.1分别处理茶叶0、6、12和24 h，对lncRNA MSTRG.139242.1及其靶基因mRNA TEA027212.1进行定量实时PCR(qRT-PCR)分析。
7 q-PCR验证
为了验证从转录组获得的lncRNA表达水平的可靠性，随机选择6个DElncRNA进行qRT-PCR验证。如图8所示，这些lncRNA的表达水平与从序列数据估计的转录本水平对应，这表明RNA-seq结果的重复性和准确性。
图8从转录组中选择6个DE-lncRNA的qRT-PCR验证。
结论
在本研究中，使用高通量转录组测序和生物信息学分析对lncRNA进行全基因组鉴定。在茶树中鉴定到16452个lncRNA，其中有172个lncRNA通过与编码基因的顺式或反式相互作用在盐胁迫下差异表达。这些lncRNA与GOL、钙信号通路，并与TF相互作用响应盐胁迫。35个DE-lncRNA与42个差异表达的编码基因相互作用，参与生长素反应、ABA和Ca2+信号转导等途径来响应盐胁迫。AsODN对LncRNA MSTRG.139242.1及其互作靶基因TEA027212.1的抑制表明，MSTRG.139242.1与Ca2+ATPase 13在Ca2+转运途径中相互作用，以响应茶树对高盐的响应。有12个lncRNA是茶树已知的17个成熟miRNA的靶标，影响下游功能基因的表达。本研究有助于深入了解茶树对盐胁迫响应的功能和调控机制。
评论
为探索lncRNA在茶树中对早期盐胁迫的反应，本研究分析了经盐处理和不对照组的茶树的转录本。对lncRNA进行了系统的鉴定和分类，预测了这些lncRNA的功能，并鉴定了响应盐胁迫的差异表达lncRNA(DE-lncRNA)。还发现lncRNA和mRNA之间的顺式和反式靶向关系以及lncRNA和非生物胁迫相关miRNA之间可能的相互作用参与了茶树的盐胁迫。本研究为挖掘参与茶树盐胁迫的lncRNA提供了有价值的资源，并加深人们对lncRNA在植物中可能的调控功能的理解。
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