科研│NAT COMMUN：阿尔兹海默病的TREM2模型中人类小胶质细胞的基因表达和功能缺陷
编译：微科盟 Marvin，编辑：微科盟景行、江舜尧。
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髓系细胞触发受体2（TREM2）作为阿尔茨海默病（AD）风险基因的发现，加速了对小胶质细胞在AD中作用的研究。虽然TREM2的小鼠模型为人们提供了重要的帮助，但TREM2在人类小胶质细胞中的相关功能仍不清楚。因此，本研究利用CRISPR生成了TREM2敲除的人类诱导多能干细胞（iPSC）分化的小胶质细胞。通过将利用转录组分析嵌合AD小鼠模型，发现TREM2缺失降低了小胶质细胞的存活，损害了包括APOE在内的关键底物的吞噬作用，并抑制了SDF-1α/ CXCR4介导的趋化作用，最终导致体内对β-淀粉样蛋白斑块的反应受损。对异种移植的人类小胶质细胞的单细胞测序进一步强调了人类TREM2敲除小胶质细胞中疾病相关小胶质细胞（DAM）反应的缺失，并通过流式细胞术和免疫组化验证了这一点。总之，本研究揭示了TREM2在人类AD进展中的关键作用。
论文ID
原名：Gene expression and functional deficits underlie TREM2-knockout microglia responses in human models of Alzheimer’s disease
译名：阿尔兹海默病的TREM2模型中人类小胶质细胞的基因表达和功能缺陷
期刊：Nature Communications
IF：11.121
发表时间：2020年10月
通讯作者：Department of Neurobiology & Behavior， University of California Irvine
通讯作者单位：美国加州大学
DOI号：10.1038/s41467-020-19227-5
实验设计
结果
1 人类iPSC分化的小胶质细胞中TREM2刺激与缺失的转录组差异
由于关于TREM2功能的初步报道表明AD相关的TREM2突变会导致部分功能缺失，因此研究者通过生成三组等基因的CRISPR修饰的TREM2敲除的iPSC来模拟这种效果。在小胶质细胞分化后，通过western blot和均相时间分辨荧光（HTRF）分析验证了所有敲除细胞系中TREM2在蛋白水平上的表达缺失（图1a）。对条件培养基的HTRF分析进一步表明，可溶性TREM2只在WT中分泌，而在TREM2敲除细胞系中不分泌（图1b），这提示野生型iPSC分化的小胶质细胞表现出TREM2的正常运输和定位，并进一步证实了TREM2在KO系中缺乏表达。
接下来，研究者通过RNA-seq来确定人类TREM2 KO小胶质细胞中被破坏的基因和通路。两组独立的TREM2等基因小胶质细胞由两个不同的患者产生，以解释任何细胞系依赖的影响（图1c-1e）。虽然两个等基因组之间存在一些差异，但许多转录本在两个KO系中表现出相同的变化。最终鉴定出390个差异表达基因，富集于包括“钙介导的信号传导调控”和“ERK1和ERK2级联反应，以及细胞迁移”等重要通路（图1c-1e）。正如预期，敲除的小胶质细胞中最显著下调的基因是TREM2本身，其次是糖蛋白NMB （GPNMB），该蛋白最近被证明在斑块相关的小胶质细胞中上调（图1d）。有趣的是，GPNMB表达缺失可导致原发性皮肤淀粉样变性，提示GPNMB可能在清除淀粉样蛋白方面发挥重要作用。与最近对AD小鼠的研究一致，TREM2缺失也导致APOE和APOC1基因表达的显著降低。
因为TREM2在小胶质细胞中表达的一些关键的下游结果可能只在TREM2信号被激活时才表现出来，所以研究者试图确定一种驱动野生型细胞中TREM2信号的最佳方法，并使用TREM2 KO小胶质细胞作为阴性对照，以进一步验证该方法的特异性。多种配体被认为可以激活TREM2下游信号，包括APOE、β淀粉样蛋白、磷脂酰丝氨酸和其他几种脂质，然而这些配体都具有多效性，与多种受体和途径结合并传递信号。另一方面，当用死去的iPSC衍生神经元片段刺激TREM2 WT和KO细胞时，两种基因型的反应相似，这表明TREM2对神经元碎片的特异性反应可能被其他小胶质细胞受体介导的信号所掩盖，如TAM受体酪氨酸激酶家族。由于发现TREM2的表达并没有实质性地改变小胶质细胞对死亡神经元的转录反应，研究者得出结论，需要一种更具体的方法来激活TREM2以进一步研究TREM2的功能。
因此，选择使用一种市售的TREM2多克隆抗体（R&D;AF1828）。类似的方案已被证明对各种免疫受体的激活有用，这种特定的抗体已被成功地用于通过裂解荧光素酶报告系统量化TREM2/DAP12信号。考虑到人们对开发TREM2激活抗体作为一种潜在的AD治疗方法的兴趣越来越大，这种方法也可以为进一步的转化研究提供数据。由于小胶质细胞表达Fc受体，当量浓度的免疫前IgG被用作额外的同型对照。通过这种方法，研究者证实AF1828暴露可使脾脏酪氨酸激酶（SYK）快速磷酸化，SYK是已知的TREM2/DAP12激活的下游信号分子（图1f，g）。相比之下，用IgG处理WT细胞或用AF1828处理TREM2敲除的小胶质细胞都不产生SYK磷酸化（图1g）。
接下来，将这种刺激方法与RNA测序相结合，以确定在抗体刺激24小时后 WT和KO小胶质细胞中表达发生改变的基因（图1h-j）。其中一些基因，在缺乏TREM2时转录本的表达降低，而在抗体刺激的WT细胞中表达增加，但在对照组IgG或载体（DPBS）处理下没有改变。对这些高度特异性的差异基因进行富集分析，发现与敲除TREM2时的富集结果相似（图1e，j），这72个差异基因也强调了趋化性（白细胞趋化性的正向调节）、特异性免疫反应家族（细胞对肿瘤坏死因子的反应）和细胞生存途径（ERK1和ERK2级联的正向调节）（图1e，j）。
为了从功能上验证这些发现，研究者下一步研究了TREM2的表达和信号通路是否会像富集分析预测的一样改变小胶质细胞的生存、吞噬和趋化作用。
图1.TREM2敲除和刺激可引起iPS衍生的小胶质细胞的转录变化。a.等基因TREM2敲除系的western blot和均匀时间分辨荧光验证。b. sTREM2由HTRF分泌。c. TREM2 WT与KO的DEG热图。d. 火山图显示TREM2 WT与KO在两条独立直线上的DEG。e. WT与KO基因集富集分析。f. TREM2抗体刺激范式示意图。g. Western blot显示，在多克隆TREM2抗体(AF1828)或对照IgG暴露5-15分钟内，WT(深蓝色)和KO(淡蓝色)小胶质细胞中的SYK发生磷酸化。h.用IgG和抗TERM2抗体处理24 h后，WT和KO小胶质细胞与WT小胶质细胞差异表达基因的Venn图。i.互变基因的基因集富集分析。j. 72个互变基因的热图。
2 TREM2敲除的小胶质细胞对应激引起的细胞死亡敏感
从之前的富集分析中，研究者发现参与调节细胞生存和凋亡的MAPK和ERK通路强烈富集（图1e，i）。此外，此前来自小鼠小胶质细胞的数据表明，TREM2缺乏导致细胞死亡增加，这一过程被假设依赖于巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）。有研究表明，TREM2与CSF1R信号通路协同工作，而CSF1R信号通路对小胶质细胞的存活至关重要。因此，研究者通过3天的细胞因子饥饿诱导人类iPS-小胶质细胞死亡，并检测三种关键细胞因子（MCSF、IL-34和TGF-β1）在小胶质细胞凋亡中的重要性（图2a）。
采用荧光caspase 3/7检测工具和延时成像技术观察小胶质细胞的凋亡。在基线水平发现与WT等基因对相比，TREM2敲除的小胶质细胞已经显示出增加的caspase信号，这并不奇怪，因为即使在没有刺激的WT和KO系比较时，MAPK和ERK通路也丰富（图1e，2b）。
在完全培养基（无细胞因子饥饿）中，WT小胶质细胞的延时成像显示caspase激活程度与预期相符（图2a，c，深蓝色）。然而，在TREM2 KO细胞系中，即使在完全培养基中也出现了凋亡增加，这表明它们可能比WT细胞系对细胞因子有更高的依赖性（图2a，c，蓝色）。正如预期的那样，细胞因子饥饿（去除M-CSF、IL-34和TGF-β1）在WT和KO细胞系中诱导小胶质细胞死亡。然而，与WT系相比，TREM2 KO系仍然表现出caspase 3/7信号的升高（图2a，c，红色），表明TREM2 KO小胶质细胞表现出对应激条件的敏感性，并通过凋亡作出反应。
为了确定这种凋亡反应是否通过M-CSF/CSF1R信号特异性发生，研究者在仅缺乏CSF1R配体（有IL-34和M-CSF）的培养基中培养人类iPS-小胶质细胞。发现，仅这一项就足以引起与完全细胞因子饥饿时相同水平的细胞凋亡（图2a，c，橘色）。相比之下，单独去除TGF-β1并不能改变caspase的激活（图2a，c，灰色）。因此，研究者得出结论，人类TREM2调节CSF1R信号通路，导致TREM2敲除系中更高水平的细胞死亡。
图2. TREM2敲除的小胶质细胞在基线和细胞因子饥饿后表现出caspase激活降低。a.在完全培养基(蓝色)，缺少TGFB1(灰色)，缺少IL-34，缺少MCSF(橙色)或缺少IL-34，缺少MCSF，缺少TGFB1(红色)培养3天的Caspase 3/7水平成像。b. 培养0 h后caspase 3/7的定量。c. 培养72 h后caspase 3/7的定量。
3 TREM2是人类小胶质细胞吞噬载脂蛋白E所必需的
载脂蛋白E （APOE）是AD最大的遗传危险因素，被认为是重要的TREM2配体。然而，目前尚不清楚APOE介导的疾病风险是否与它和TREM2的相互作用相关。此外，本研究测序数据突出了脂质转运的差异（图1e），促使进一步研究TREM2和APOE之间潜在的相互作用。因此，将TREM2等基因细胞系暴露于一系列外源重组的脂化APOE中（图3a）。
有趣的是，研究者发现小胶质细胞对APOE的吞噬依赖于APOE的基因型，APOE4的内化率明显高于APOE3，而APOE3的内化水平高于APOE2（图3a）。重要的是，所有这些吞噬作用的差异是基于外源性添加蛋白的APOE基因型，而不是小胶质细胞自身的APOE基因型。研究者需要进一步的研究来确定这是否对AD的发展至关重要，但是这一数据强调了APOE的不同基因型被小胶质细胞区别识别。
接下来，研究了TREM2表达对APOE吞噬的重要性。当TREM2表达缺失时，研究者检测到APOE荧光吸收不显著高于载体对照（图3a）。考虑到TREM2敲除的小胶质细胞仍然表达其他典型的APOE受体，这种明显的差异令人惊讶。事实上，RNA测序显示，包括LDL2、LRP1和HSPG2在内的典型APOE受体的表达在细胞系之间没有变化。因此，即使在其他APOE受体存在的情况下，TREM2敲除的小胶质细胞也不会吞噬可检测到的脂化APOE蛋白，这表明TREM2是人类小胶质细胞吞噬APOE所必需的。
为了进一步了解TREM2信号通路在APOE吞噬中的作用，研究者还用SYK抑制剂R406预处理了iPS-小胶质细胞来阻断TREM2的信号转导（图1f）。在这些实验中使用了APOE最常见的突变体APOE3。用R406预处理小胶质细胞可以部分但显著地阻断APOE在WT细胞中的吞噬作用，表明这种吞噬作用确实是通过TREM2/DAP12信号通路发生的（图3b）。
4 TREM2对吞噬纤维-淀粉样蛋白和人类突触体至关重要，但对吞噬酵母聚糖A没有作用
由于TREM2被认为是体内被小胶质细胞吞噬的许多配体的受体，所以研究者将TREM2等基因细胞系暴露于其他几种底物中，以测试是否会揭示相应的功能差异。首先，将TREM2等基因细胞系暴露于纤维-淀粉样蛋白。正如预期的那样，KO系中β -淀粉样蛋白的吞噬量显著降低（图1c）。通过用R406阻断SYK，进一步证实了对TREM2/DAP12下游信号通路的需求。重要的是，在TREM2 KO细胞系中阻断SYK没有效果（图1c）。
为了验证之前表明TREM2可能在突触修剪中发挥作用的研究，研究者接下来将小胶质细胞暴露于分离自AD脑组织的pHrodo标记的人类突触中。有趣的是，TREM2敲除的小胶质细胞对突触小体的吞噬作用受损，表明TREM2可能在突触修剪中发挥了重要作用（图3d）。同样，用R406通过SYK阻断下游的TREM2信号可以部分阻断WT系中突触体的吞噬，这凸显了TREM2/DAP12信号在吞噬该配体中的重要性。
为了研究所观察到的吞噬功能下降是仅限于疾病相关的底物，还是代表了更全面的吞噬活性下调，研究者测试了对酵母聚糖A （dectin 1/2激动剂）的吞噬功能（图3e）。这种对照配体被WT和TREM2敲除细胞吸收得同样好，并且SYK抑制不会改变酵母聚糖A的吞噬，这表明TREM2信号的丢失导致底物特异性吞噬缺陷（图3e）。
5 TREM2抗体刺激会部分改变吞噬功能
为了进一步探索TREM2 KO细胞系的吞噬缺陷，研究人员先用TREM2抗体预刺激等基因小胶质细胞，并用IgG作为对照，再将细胞暴露于APOE3、β -淀粉样蛋白、突触体或酵母聚糖A。正如预期的那样，TREM2抗体处理的TREM2敲除株没有任何效果。TREM2抗体处理的WT细胞降低了对于APOE3和人突触体的吞噬作用，这种减少可能是由于抗体刺激后的内化作用，在二次刺激反应中临时模拟了功能表型的丧失。对于β-淀粉样蛋白和酵母聚糖A，TREM2抗体没有作用，这表明TREM2受体本身可能不直接负责开始吞噬这些底物。然而，在β-淀粉样蛋白的情况下，研究者确实显示SYK信号是重要的（图3c）。这一发现与之前对其他几个小胶质细胞受体的鉴定相吻合，这些受体与小胶质细胞的β -淀粉样蛋白内化有关。此外，这可能表明，与TREM2和β-淀粉样蛋白的直接结合相比，SYK激活状态的变化可能更强烈地影响TREM2中β -淀粉样蛋白吞噬的减少。
6 TREM2缺失减少了淀粉样斑块周围的聚集，并损害了向产生β-淀粉样蛋白培养物的迁移
几个小组之前已经表明，TREM2缺陷小鼠小胶质细胞在β淀粉样斑块周围聚集减少。为了确定人类TREM2基因敲除的小胶质细胞是否存在类似的损伤，研究者将表达GFP或RFP的等基因人类小胶质细胞移植到5x-MITRG小鼠的大脑中（图4a）。这些5x-MITRG转基因小鼠由5x-fAD小鼠与MITRG异种移植相容小鼠（hCSF1, hCSF2,hTPO, Rag2基因敲除，il2rγ基因敲除）回交获得，以检测移植的人小胶质细胞在体内的功能行为。利用这种方法，将WT和TREM2基因敲除的人类小胶质细胞组合（GFP:WT, RFP:TREM2 KO或反之）共移植到2-3只6个月大的小鼠中。脑切片用硫黄素S类似物Amylo-Glo染色，以检测纤维-淀粉样斑块。正如预期的那样，WT人类小胶质细胞对β-淀粉样斑块病理表现出稳健的反应，以一种与在人类AD组织中观察到的高度相似的方式包围斑块。与之形成鲜明对比的是，TREM2基因敲除的人类小胶质细胞似乎对斑块病理无反应，与斑块很少或几乎没有关联，而且缺乏等基因野生型小胶质细胞中观察到的特征性形态学变化（图4a）。这些数据与小鼠TREM2敲除小胶质细胞对斑块病理的反应以及在人类TREM2 R47H病例中的观察结果高度一致，但也代表了所知的第一份研究TREM2缺失对人类小胶质细胞斑块关联影响的报告。
因为，在体内，β-淀粉样斑块是相当复杂的，不仅包括β-淀粉样蛋白本身，还包括许多其他蛋白、营养不良神经突和反应性星形胶质细胞，所以进行了体外迁移试验，以确定TREM2敲除细胞是否仅表现出向β -淀粉样蛋白迁移的受损，或者AD神经元产生的额外信号是否可能进一步影响小胶质细胞和斑块病理之间的联系。为此，使用了双腔微流体迁移装置来测量WT和KO小胶质细胞向可溶性β-淀粉样蛋白或产生人类神经元/胶质混合培养物的β-淀粉样蛋白的迁移。虽然野生型和KO小胶质细胞在向Aβ1-40或Aβ1-42单独迁移时没有观察到显著差异，但Aβ1-40和Aβ1-42更多的生理组合揭示了TREM2敲除的小胶质细胞迁移的显著障碍（图4b）。
为了确定额外的神经来源线索是否可能影响TREM2介导的趋化性，研究者还分析了小胶质细胞向产生Aβ的人类神经元和中央腔内的星形胶质细胞的迁移。通过将3周的神经元和星形胶质细胞共同培养，尽管TREM2敲除迁移已经明显受损，还是观察到极小的小胶质细胞募集（图4c）。然而，当神经元和星形胶质细胞发育到9周时（之前的研究表明该系统中淀粉样病变和细胞死亡增加的时间点），观察到WT小胶质细胞显著迁移到中央室，而TREM2敲除的小胶质细胞对这些细胞来源的趋化信号完全没有反应（图4c）。
一个突出的问题是，观察到的迁移缺陷是由于TREM2敲除细胞无法感知和响应化学吸引线索，还是仅仅是TREM2敲除细胞无法移动。为了解决这个问题，研究者进行了划痕实验来观察TREM2 WT和KO小胶质细胞的一般运动性。本实验显示WT和TREM2敲除小胶质细胞的基线运动没有显著差异，这表明上述量化的差异是特异性的趋化迁移（图4d）。
7 CXCR4介导TREM2敲除的小胶质细胞的迁移缺陷
为了进一步研究TREM2 KO小胶质细胞迁移受损的机制，返回到RNA-seq数据中，发现一个重要的化学吸引受体CXCR4的表达在TREM2敲除细胞中减少。对等基因的WT和TREM2敲除的小胶质细胞进行免疫荧光和流式细胞术分析，进一步证实该受体在TREM2敲除株的蛋白水平上下降（图5a，b）。更有趣的是，CXCR4在小鼠疾病相关的小胶质细胞（DAMs）和最近对斑块相关的人类小胶质细胞的研究中都表现为表达量增加，进一步支持了该受体在小胶质细胞向斑块迁移中的潜在作用。CXCR4也被认为是外周免疫系统的趋化因子受体，响应配体SDF-1α （CXCL12）。CXCR4是一种典型的G蛋白偶联受体（GPCR），它的参与导致Gq/11的激活，随后通过IP3介导的ER-store释放提高胞浆Ca2+，这是一种下游反应，也涉及到TREM2信号。在大脑中，SDF-1α在神经元和星形胶质细胞中高度表达，特别是在海马区，SDF-1α的增加促进了AD小鼠斑块的小胶质细胞的招募。
为了研究CXCR4信号在iPS-小胶质细胞中的潜在作用，用Fluo-4和Fura-Red诱导细胞以用于比率Ca2+成像，并在无Ca2+缓冲液中使用SDF-1α处理，以明确地分离通过CXCR4激活的下游Ca2+信号。通过这种方法，发现WT小胶质细胞对SDF-1α的反应显著高于TREM2敲除的小胶质细胞（图5c）。对单个细胞反应的分析进一步表明，在WT和TREM2敲除的小胶质细胞中，只有一小部分细胞被SDF-1α激活（图5c），这表明，只有一小部分小胶质细胞对SDF-1α信号有反应，而在TREM2基因敲除的小胶质细胞中，这一比例显著降低（WT中39%响应，KO中11.5%响应）。单细胞定量显示，在TREM2敲除的小胶质细胞中，SDF-1α的平均Ca2+峰值响应也较低（图5c）。这些结果强烈表明，TREM2敲除的小胶质细胞对SDF-1α的敏感性较低，这可能是由于观察到的CXCR4 mRNA和膜定位的CXCR4蛋白表达较低，这也可能解释了它们的迁移缺陷。
接下来，为了确定CXCR4信号是否对迁移有必要，使用AMD3100阻断CXCR4受体在小胶质细胞向星形胶质细胞和神经细胞迁移过程中的活性。先前的数据强调，这种神经元和胶质细胞的混合模型确实表达了SDF-1α，此外，与健康对照组相比，使用产生Aβ的神经元和星形胶质细胞时SDF-1α表达增加。观察到WT小胶质细胞仅在SDF-1α被诱导（AD神经元）且CXCR4信号功能正常的培养环境中迁移（图5d）。这些数据强烈表明CXCR4是人类小胶质细胞向表达β-淀粉样蛋白的神经和星形胶质细胞迁移的必要条件。因此，这些数据支持了一种可能性，即在TREM2缺陷的小胶质细胞中激活CXCR4可能是一种有助于小胶质细胞向死亡细胞或淀粉样斑块迁移的方法。
图5. REM2敲除的小胶质细胞缺乏CXCR4，而CXCR4是迁移所必需的。a. CXCR4(绿色)、IBA-1(红色)在TREM2等基因系中的表达。b. CXCR4:APC的流式细胞术。c. 加载了荧光-4(绿色)和呋喃红(红色)的WT细胞和用SDF-1α激活的TREM2 KO细胞的最大强度投影图像随时间的叠加。d. WT小胶质细胞被允许迁移到9周龄的健康或中央腔内培养的产生β-淀粉样蛋白(AD)神经/胶质细胞(白色虚线圈)。
8 TREM2敲除的小胶质细胞在体内无法适当应对淀粉样斑块
研究表明，在AD小鼠的DAM亚群中TREM2的表达增加，这是向这种表型转变所必需的。然而，作者实验室和其他实验室的最新数据表明，与人类DAM形成相关的基因与先前定义的小鼠数据集有有限的重叠。为了确定TREM2 KO是否影响人小胶质细胞中DAM的形成，将iPS来源的造血祖细胞共移植到出生后2-3天的MITRG小鼠幼鼠中，以便在同一只小鼠中直接比较WT和KO人小胶质细胞。为了鉴定哪些小胶质来自TREM2 WT和敲除的iPSCs，将表达RFP的WT细胞与表达GFP的KO细胞混合，反之亦然。利用这项技术，发现人类小胶质细胞可以长期植入小鼠前脑。当与5xfAD小鼠杂交得到5x-MITRG时，还发现这些细胞对疾病的发生和进展做出了特有的形态学和转录改变。在从6个月大的MITRG或5x-MITRG小鼠大脑中分离出人类小胶质细胞后，进行了单细胞RNA测序，以观察人类小胶质细胞的亚群。在未患病的MITRG小鼠中，研究者发现了4个转录不同的小胶质细胞亚群（图6a）。通过分析每个群体中与整个数据集最显著不同的基因，确定了这四个亚群体的差异基因涉及：主要组织相容性复合体（MHCII）和人类白细胞抗原（HLA）呈递（34.2%），I型干扰素应答（10.8%），一个定义模糊的“degranulation”的小亚群（1.9%），和一个“内稳态”簇，表达高水平的典型和内稳态小胶质细胞基因，但缺乏定义其他簇的基因表达（53.1%）（图6a）。然而，将TREM2基因敲除的小胶质细胞移植到同种小鼠时，发现，即使在非患病小鼠中，这些亚群的百分比也朝着更稳定的方向变化（图6a），这与TREM2缺失可能使小胶质细胞陷入内稳态的观点一致，不仅是在疾病中，也存在于对正常衰老的反应中，这表明TREM2基因敲除的小胶质细胞在本质上是低反应性的。
接下来，研究者检查了WT和TREM2敲除的小胶质细胞，这些小胶质细胞已被共移植到同窝的5x-MITRG小鼠幼鼠中，并允许其生长6个月。当检测移植到AD模型的WT小胶质细胞时，研究者发现了5个转录不同的亚群（图6b）。在非AD小鼠中发现的4个亚群仍然存在，另外还有一个亚群与最近描述的人类DAM类群相匹配。正如预期的那样，暴露于β-淀粉样病变后，WT小胶质细胞从稳态和干扰素高表型转向了DAM表型（图6a）。
然而，当检测移植到AD模型中的TREM2基因敲除的小胶质细胞时，研究者发现这些细胞未能正常激活，AD小鼠中77%的TREM2基因敲除的小胶质细胞保持稳态，只有1.8%的小胶质细胞向DAM亚型转变。作者还注意到TREM2 KO小胶质细胞中HLA簇的富集程度降低了约2倍。因此，人类TREM2基因敲除的小胶质细胞在对β-淀粉样蛋白病理反应方面表现出与小鼠小胶质细胞类似的损伤，尽管这个丢失的“DAM”群体的精确基因集仅部分与小鼠对应基因集重叠（约12%）。
9 TREM2敲除的小胶质细胞在体内不形成DAMs
由于单细胞测序是对每个基因型的一种动物进行的，而且RNA并不总是与蛋白质表达直接相关。接下来研究者试图通过在更大队列的小鼠中检测蛋白质表达来证实研究的结果。为了验证发现，即在AD模型脑的WT细胞中CD9表达增加，研究者对所有4组动物（MITRG + WT, MITRG + KO, 5xMITRG + WT, 5x-MITRG + KO）进行了CD9（DAM亚群的标记基因）流式细胞术检测。同样，使用共移植的动物，来自同一个大脑的细胞可以通过GFP或RFP表达来分离，以表示TREM2基因型图（图6c），这一分析证实了非患病动物（MITRG）表达非常低水平的CD9蛋白。研究者还证实AD模型脑（5x-MITRG）中WT细胞的CD9水平明显高于来自同一大脑的KO细胞。事实上，在非疾病和AD模型大脑中，KO细胞的CD9阳性DAM数量没有显著差异（图6c）。这再次表明，尽管暴露于β-淀粉样病变，TREM2 KO细胞仍被锁定在内稳态。由于这些细胞是从WT和KO细胞共移植的大脑中分离出来的，这些结果也表明，激活的WT细胞的存在不足以在附近的KO细胞中诱导DAM表型。
为了进一步在解剖水平上验证单细胞测序和流式细胞术结果，研究者对同一共移植小鼠的大脑皮层切片进行了检查。HLA和DAM标记物的表达在β-淀粉样蛋白斑块周围特异性增加，这与最近发表的文章一致。作者强调，TREM2敲除的小胶质细胞（GFP）在WT细胞（RFP）中并不表现出典型的斑块相关的HLA标记物（图6d，HLA-DRB1）或DAM标记物（图6e,，CD9）表达增加，这与TREM2敲除细胞锁定到一个更稳定的表型的观点一致。重要的是，用相反的GFP/RFP细胞组合移植的小鼠显示TREM2 KO （RFP）小胶质细胞中CD9和HLA-DRB1的同等损失。总之，这些数据有力地表明，人类TREM2基因敲除小胶质细胞在体内无法激活对β-淀粉样斑块的反应。
结论
本研究揭示了TREM2参与了CSF1R依赖的小胶质细胞生存、SYK依赖的突触体吞噬、β-淀粉样蛋白和APOE以及CXCR4依赖的小胶质细胞迁移，人类DAM反应的形成，阐明了小胶质细胞在人类AD进展中可能的重要作用。