编译：刘娟，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
巨噬细胞是胚胎发育过程中出现的新生免疫系统中最早的细胞。在小鼠身上，胚胎巨噬细胞浸润正在发育的器官并在这些器官内向组织驻留巨噬细胞(TRMs)共生分化。然而，我们对巨噬细胞在人类胚胎中的起源和特征的了解仍然有限。本文从Carnegie分期为11至23阶段的人类胚胎中分离出CD45+造血细胞，通过单细胞RNA测序对其进行转录分析，然后通过单细胞培养对CD45+CD34+CD44+卵黄囊来源的髓样倾向祖细胞(YSMPs)种群进行功能表征分析。研究绘制了多个解剖部位的巨噬细胞异质性，并确定了不同的亚群，包括不同类型的胚胎TRM(头部、肝脏、肺和皮肤)。利用转录组和发育分期信息，研究进一步追踪了来自卵黄囊来源的原始巨噬细胞或YSMP来源的胚胎肝单核细胞的TRMs的轨迹并重点关注小胶质细胞。最后，研究评估了胚胎期TRMs和成年TRMs之间的分子相似性。全文数据描述了人类胚胎发生过程中早期巨噬细胞发育的空间动态，为今后研究人类TRMs的发育和功能提供了参考。
原名：Deciphering human macrophage development at single-cell resolution
译名：单细胞技术解析人巨噬细胞的发育
期刊：Nature
IF: 43.07
发表时间：2020年6月15日
通讯作者:Yu Lan; Florent Ginhoux; Bing Liu
通讯作者单位：Jinan University; Guangzhou Regenerative Medicine and Health-Guangdong Laboratory; Academy of Military Sciences, Beijing; Fifth Medical Center of Chinese PLA General Hospital ;Nanyang Technological University; Shanghai JiaoTong University
DOI号：10.1038/s41586-020-2316-7
巨噬细胞以其免疫功能最为人所知，但越来越多的证据表明，巨噬细胞还有其他作用，包括调节造血微环境、影响新陈代谢、介导组织修复和调控胚胎组织的成熟。这些不同的作用反映在不同个体的发育上，其中一些TRMs来自于成人骨髓来源的造血干细胞(HSCs)，而另一些则来自胚胎造血前体细胞发育的早期。哺乳动物胚胎造血是一个复杂的过程，涉及多个短暂重叠的程序。小鼠命运图谱分析（Fate-mapping）的研究表明,巨噬细胞发育在胚胎造血作用比功能HSCs更早，最早祖细胞出现在卵黄囊两个截然不同的波中:早期c-Myb独立原始波出现在胚胎7.5天,和后来c-Myb依赖性红血球样组细胞（EMP）出现在胚胎8.25天。第一波中的祖细胞在原位分化为巨噬细胞，并迁移到脑部，成为小胶质细胞的主要来源。第二波祖细胞最初被定义为EMPs，在原位分化为巨噬细胞，并迁移到胎儿肝脏，产生多种谱系，包括单核细胞，单核细胞将迁移到不同的发育组织中，并在出生前分化为TRMs。虽然胚胎巨噬细胞的特化和发育在小鼠身上已被详细的研究过，但在人类中尚不清楚。研究报道过第一个有功能的造血干细胞在Carnegie期(CS) 14阶段出现在主动脉性腺中肾区，稍晚出现在CS期16阶段的卵黄囊，而在肝脏中第一个有功能的造血干细胞出现在CS期17阶段。然而，难以获得用于研究的早期人类胚胎以及传统方法无法准确分析分离出的极其少量的早期胚胎细胞，这两点阻碍了研究的进展。本研究从流产后获得的8个早期人胚胎中分离出一系列组织，然后对CD45+造血细胞群进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)，从而研究人类胚胎造血的空间分布和动态过程，并回答有关人巨噬细胞的起源和特化的问题。
1.人胚胎造血的单细胞测序
为了研究人巨噬细胞的发展,研究采用流式细胞术FACS来分离CD45+CD235a-造血细胞，这些细胞存在于8个流产后胚胎不同的CS阶段(从CS11到CS23阶段,相当于大约24－56天的发育) 各种解剖位点(卵黄囊、头、肝、血液、皮肤和肺)（图1a）。然后研究采用了一种改进的scRNA-seq方法，又称之为单细胞标记逆转录测序(STRT－seq)。研究利用来自1231个单细胞的高精度质量控制的转录组数据(图1b)，根据已知特征基因的表达情况解析了15个基因簇(图1b,c)。卵黄囊来源的祖细胞和巨噬细胞是最早出现的CD45+造血细胞,出现在卵黄囊CS11阶段(图1d)。值得注意的是,这些祖细胞表明转录组红系的特性明显弱于小鼠EMPs，表明他们的髓性倾向,因此也被称为卵黄囊来源的骨髓倾向的祖细胞(YSMPs)。YSMPs和造血干组细胞(HSPCs)均表达高水平的CD34和MYB，但HSPCs仅在CS17阶段后的肝脏中出现，并且特异性表达HOX家族转录因子，如HOXA6和HOXA10(图1c, d)。对CS12阶段以后进行研究，在肝脏中检测了以MYB、MPO和LYZ高表达为特征的粒细胞单核细胞祖细胞(GMPs)群体。这与发生在CS12阶段的CD7lo祖细胞形成对比，它表达淋巴相关(CD7和IL7R)和髓系(MRC1和CD14)基因，以及从CS15阶段以后在肝脏中被识别出的CD7hi祖细胞，CD7hi祖细胞表达更高水平的IL7R和CD7基因。在CS13阶段的卵黄囊中出现了表达高水平CMA1和CPA3的肥大细胞，然后从CS15阶段开始出现在肝脏、血液和皮肤中。以RORC表达为特征的先天性淋巴样细胞(ILCs)最早CS17阶段就在卵黄囊中被检测到(图1c,d)。值得注意的是，两个种群(巨噬细胞Mac1和巨噬细胞Mac4)与其他种群聚集在一起(图1b)。Mac1细胞主要表达在卵黄囊CS11阶段并表达卵黄囊基因S100A120以及高水平的内皮标志物CDH5。相比之下,Mac4细胞主要位于头部,这是唯一表达SALL1和gliomedin (GLDN)的种群,表明这些细胞代表正在发育的小胶质细胞。
研究进一步通过高通量10x基因组学分析验证STRT-seq。首先,研究重新分析采样于CS11至CS17阶段的卵黄囊(YS)细胞并开展STRT-seq分析,发现两个巨噬细胞种群:YS-Mac1细胞（主要在CS11阶段胚胎中）和YS-Mac2细胞（主要在CS15阶段胚胎中）。从CS11和CS15阶段卵黄囊中获得的10x基因组学数据同样识别出两个巨噬细胞种群。然后，研究通过STRT seq从YS-Mac1和YS-Mac2簇中识别出的前10个差异表达基因(DEGs)投射到10x基因组数据中，发现了相似的基因表达模式。最后，研究识别出CD34和CD44作为YSMP种群的假定标记，并对这些细胞进行分类以确定它们的功能特性。
大规模卵黄囊细胞的培养表明造血组细胞容易被检测到其中的CD45+CD34+CD44+种群(YSMPs),但大部分CD33+骨髓细胞不属于CD45+CD34+CD44+种群。在184个YSMP单细胞培养发现在67个(36%)造血细胞簇。随机选取39个培养孔，采用流式细胞仪进行分析。62% (24孔)有多谱系的潜能, 其中大部分（22孔）含有CD14+单核／巨噬细胞以及CD66b+粒细胞。值得注意的是，92%（36孔）表现出髓系的潜能（CD33+），其中23孔表现出单核／巨噬细胞分化潜能，而5%(2 孔)表现出红系潜能(Fig.1e)。这些数据证实了人YSMPs的骨髓偏向多谱系的潜能，符合其转录特征。
2.YSMP在胚胎肝中的发育
为了研究人的YSMPs是否也能在体内产生不依赖于HSPC的单核细胞，我们研究了肝脏中CS17阶段前的(第一次检测到转录定义的HSPCs之前的阶段)的髓系相关细胞簇。主成分分析(PCA)表明YSMPs表达CD34和MYB是位于GMP和成髓细胞种群之间(图2 a, b),这些细胞逐渐表达嗜中性粒细胞基因如CEACAM8,同时也增加了单核细胞标志物（人CCR2和HLA-DRA）的表达(图2 b),表明YSMPs可以分化为两种不同的路径。使用monocle的轨迹分析同样揭示了YSMPs产生的两种不同的细胞命运(图2c, d)。基于基因表达谱，YSMPs似乎可以在体内同时产生单核细胞和中性粒细胞(尽管我们在分析中无法捕获成熟的中性粒细胞)，这与我们在体外功能试验中观察到的YSMPs相似。比较两个分支之间的DEGs显示这些细胞的共性包括MYB、MPO和MS4A3的表达,而单核细胞分支只表达CCR2和CD14基因,嗜中性粒细胞开始表达规范的中性粒细胞标志物如S100A9和CEACAM8(图2e)。
3. 卵黄囊来源的胚胎TRMs的两波
我们需要回答的一个重要问题是巨噬细胞的来源和特化在人类和小鼠中是否相似，在小鼠中有两种卵黄囊来源的波:一种是在早期卵黄囊中独立于单核细胞的原始波，另一种是在晚期胎肝中单核细胞衍生波。
为了研究这个,我们首先重新聚类分析识别巨噬细胞和巨噬细胞相关种群(图3a),并在解析的基础上表达他们独特的表达特征，阶段和位置的信息，用一系列小鼠TRM特异性基因来支持我们的解析。仔细看这些种群之间的独特DEGs,表明这些细胞可能已经启动组织固有程度,与肝脏巨噬细胞种群表达SPIC,血液巨噬细胞表达CCL13,肺的巨噬细胞和皮肤巨噬细胞分别表达他们BMX和MMP1基因(图3 b)。分级聚类显示，头部巨噬细胞Head_Mac3、头部巨噬细胞Head_Mac4和肝脏巨噬细胞Liver_Mac远离其他巨噬细胞组聚集(图3c):我们推测这可能是因为它们是更成熟的TRMs，因此选择它们进行进一步分析。
YS_巨噬细胞YS_Mac1组与我们预先鉴定的巨噬细胞Mac_1组相对应(图1c)，后者在巨噬细胞中唯一表达内皮基因CDH5(图3d)，并显著表达红细胞相关HBE1基因。HBE1的高表达是卵黄囊来源的原始有核红细胞的标志,这导致我们思考YS_巨噬细胞1/巨噬细胞2(YS_Mac1/Mac_1)也许是一种相关的谱系属于早期卵黄囊来源的原始巨噬细胞波。综合我们的分析表明,在小鼠的发育过程中，这些细胞是卵黄囊来源的原始巨噬细胞,其中一些早期迁移到头部小胶质前体细胞。
在建立YS_巨噬细胞1（YS_Mac1）种群后，本文研究了早期人卵黄囊来源的胚胎巨噬细胞的发育轨迹。在HSPCs出现之前，研究人员分析了CS11至CS17阶段的巨噬细胞相关种群，而HSPCs很可能来自一个单独的谱系。对这些种群的Carnegie阶段的短期评估显示，YS_Mac1最早出现在CS11阶段，并首先形成主要巨噬细胞群体，而YSMPs产生单核细胞来源的巨噬细胞，但只出现在CS17阶段之后(图3e)。关键谱系定义基因的表达呈现类似的模式(图3d)， YSMPs表达较高水平的MYB，并产生表达MPO的祖细胞，这与对斑马鱼胎儿单核细胞的研究一致。同样的，YS_Mac1种群从一开始就有很强的巨噬细胞识别，表达CD163和MRC1。YSMPs和YS_Mac1细胞均表达CDH5，这与其卵黄囊来源的内皮细胞来源一致。因此，我们的数据表明人类早期胚胎巨噬细胞的发育过程与小鼠和斑马鱼非常相似。
4. 人小胶质细胞的起源和特征
在小鼠中，小胶质细胞主要来源于卵黄囊来源的原始巨噬细胞的第一波。为了研究人类胚胎中小胶质细胞的来源和特化，我们将重点聚焦在CS11至CS23阶段头部组织中的巨噬细胞。聚类分析显示，这些巨噬细胞可被分为5组(Head_Mac0－Head_Mac4)，它们的特征与其发育阶段高度相关。Head_Mac0与YS Mac1基因特征完全重叠;再加上在这个时间点，卵黄囊是巨噬细胞的唯一来源，这表明YS Mac1导致CS11阶段的头部出现巨噬细胞(图4a)。CS17阶段的头部也可以看到来自YSMPs的少量单核细胞。然而，它们与其他头部巨噬细胞种群数量有差异，以及它们出现的时间较晚，都表明它们可能只占有很小的比例。5组头部巨噬细胞群体的相继出现表明，这些群体是连续发育细胞的一部分，其经典小胶质细胞相关基因CX3CR1、SALL1和SPP1的表达进一步支持了这一观点，即这些细胞正向小胶质细胞的命运发展(图4b)。接下来，我们根据五组头部巨噬细胞簇在CS11至CS23阶段的顺序，研究小胶质细胞的动态变化(图4c)。大多数基因在patter1和pattern2中的表达水下降，其中一些基因如CD163和CD1C与免疫活性相关。我们还发现组织发育和神经发育基因如IGF126和TMSB4X27表达增加。对转录因子的研究显示了类似的趋势(图4d)，头部巨噬细胞失去了炎性转录因子如IRF7和STAT1的表达，而获得了小胶质细胞的身份，表达BHLHE41、JUN、FOSB、NR4A1和SALL1;这些变化反映了在小鼠小胶质细胞发育过程中观察到的模式。最后，我们整合了胚胎数据和公开的成人头部、肝脏和肺部TRMs数据，以及8岁和10岁儿童皮肤样本数据。研究结果证实，胚胎中的小胶质细胞群体已经发生了分化，胚胎和成年小胶质细胞聚集在一起。同样，肝脏中TRM的命运也开始明确，尽管程度不及头部巨噬细胞。与皮肤TRM相比,只有轻微的CD207表达在CS23阶段和轻微重叠的胚胎和儿科样本综合数据集。然而，尚未有研究在胚胎肺上开展。我们目前对胚胎造血的了解大多是基于动物模型，如小鼠或斑马鱼。对人卵黄囊来源的巨噬细胞及其祖细胞的研究并不明确，本研究在这方面开展探索和分析。尽管人们普遍认为哺乳动物的造血过程是高度保守的，但这些细胞在人类中的特性迄今仅限于显微镜观察或外植体实验。通过利用成熟的单细胞测序技术和生物信息学，我们的分析保持组织位置和时间信息。在小鼠模型中通常使用fate-mapping 工具，但在人体不能使用该工具，因此很难确定人类不同TRM亚群的个体发生，但我们已经确定了两种不同的且HSC依赖的巨噬细胞波。这在临床中尤为重要。因为巨噬细胞是组织发育和稳态平衡的重要调节因子，了解它们的功能和发育途径对于诊断和治疗其失调引起的病理至关重要。在描述疾病中发现的巨噬细胞亚群时，必须考虑这些不依赖于HSC的波的作用，因为许多研究已经证实，不依赖于HSC的巨噬细胞从其HSC衍生的部分中保持着独特的转录组和表观遗传特性。具体地说，我们在转录组和功能上表征的人类YSMPs可能与小鼠的EMPs相对应，后者表现出类似的空间动态和造血祖细胞特征。然而，在小鼠EMPs的培养物中很容易观察到红系的潜力，这与其显著的红系的特性转录组一致。这些观察结果值得进一步研究，以进行深入的比较，并确定相关的调控机制。在我们的研究中发现的胚胎巨噬细胞也提供了一个有趣的机会来重新评估我们常用的TRM模型。在人类研究中，传统的方法是通过体外培养CSF-1从血液单核细胞中生成巨噬细胞。比较这些体外单核细胞来源的巨噬细胞和真正的卵黄囊来源的巨噬细胞，最初胚胎组织可能揭示这些细胞之间重要的相似性和差异，并允许更好的实验设计和解释结果。我们的研究也支持了对诱导多能干细胞(iPS)细胞来源的巨噬细胞和基于这些细胞开发的各种TRM系统的进一步理解。虽然小鼠原始巨噬细胞和iPS细胞来源的巨噬细胞之间的直接比较已经证明了它们彼此相似但又不同于HSC来源的巨噬细胞，但据我们所知，还没有研究对人巨噬细胞进行同样的比较。我们的研究将有助于理解这些iPS细胞来源的巨噬细胞的个体发育。
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