科研| Cancer Cell：PKCλ/ι缺失诱导自噬、氧化磷酸化和NRF2而促进肝癌发展

编译：阿温，编辑：夏甘草、江舜尧。

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导读

氧化应激在肝组织损伤和肝细胞癌(HCC)的发生发展中起着重要作用。然而，在活性氧(ROS)产生过程中调控自噬和代谢重编程的机制，以及ROS如何促进肿瘤发生，仍需要进行充分了解。我们发现，肝细胞中蛋白激酶C (PKC) λ/ι的缺失会促进自噬和氧化磷酸化。这导致ROS产生，并通过NRF2介导细胞自主和非自主机制地驱动HCC。尽管PKCλ/ι在癌基因驱动的癌症模型中促进肿瘤发生，但新的证据表明，在更复杂的致癌过程中，它是一个肿瘤抑制因子。同时，PKCλ/ι水平与HCC组织学肿瘤分级负相关，这表明该激酶在HCC中可以抑制肿瘤。

论文ID

原名：PKCλ/ι Loss Induces Autophagy, Oxidative Phosphorylation, and NRF2 to Promote Liver Cancer Progression

译名：PKCλ/ι缺失诱导自噬、氧化磷酸化和NRF2而促进肝癌发展

期刊：Cancer Cell

IF：26.602

发表时间：2020.8.10

通讯作者：Jorge Moscat

通讯作者单位：桑福德伯纳姆普利贝斯医学研究所

DOI号：10.1016/j.ccell.2020.05.018

实验设计

结果

1. 肝细胞特异性PKCλ/ι的缺失可促进HCC

为了探索PKCλ/ι蛋白在小鼠肝脏肿瘤中的表达，我们对2周大的野生型(WT)小鼠进行内源性HCC治疗方案，包括注射25 mg/kg的肝致癌物二乙基亚硝胺(DEN)，然后喂高脂肪饮食(HFD)作为肿瘤启动子。这是一个完善的模型，概括了肥胖条件下的肝癌促进。在36周时，DEN/HFD治疗的小鼠出现了多种组织学级别的肝脏肿瘤，从良性腺瘤到高级别肿瘤不等(图S1A)。PKCλ/ι在腺瘤中表达最高，随着肿瘤去分化程度的加深而逐渐降低(图S1A)。肿瘤组织学分级与PKCλ/ι表达呈负相关，提示PKCλ/ι表达降低可能有助于增强癌细胞的侵袭性。为了建立PKCλ/ι在肝脏生理和肿瘤中的作用，我们将Prkcif/f与Alb-Cre小鼠杂交，得到肝细胞中PKCλ/ι选择性缺失的小鼠(Prkcif/f; Alb-Cre)。这些小鼠以预期的孟德尔比率出生，在30周时进行分析，发现肝脏表面粗糙，边缘钝，表明慢性肝损伤(图1A和1B)。Prkcif/f; Alb-Cre小鼠的血清丙氨酸转氨酶(ALT)升高，反映肝损伤(图1C)。肝脏组织学表现为弥散性细胞坏死，胞浆嗜酸性和肿胀，细胞核褪色(图1D)。在突变的肝脏中没有脂肪变性的迹象，但组织学分析显示细胞死亡，包括肝细胞凋亡(图S1B)。在Prkcif/f; Alb-Cre小鼠中检测到肝纤维化(图S1C)，肝细胞增殖增加(图S1D)。年龄较大的Prkcif/f; Alb-Cre小鼠(33-52周)有类似的组织学表现，表现为肝损伤、细胞死亡、细胞浸润(图S1E)、纤维化(图S1F)和肝细胞增殖增加(图S1G)。在喂食鼠粮(RD)的实验期间，Prkcif/f; Alb-Cre小鼠均未出现任何类型的肿瘤。然而，这些突变肝脏中细胞死亡和增殖的增加提示了一个有利于癌症的微环境。为了验证这种可能性，采用DEN/HFD方案对Prkcif/f; Alb-Cre小鼠进行实验(图1E)。与RD喂养的小鼠相似，DEN/HFD喂养下的小鼠血清中ALT升高(图1F)。然而，与RD喂养的小鼠相比，无论雄性还是雌性DEN/ HFD处理的Prkcif/f; Alb-Cre小鼠肝癌发生增强(图1G-1I)，而且细胞凋亡增加，脂肪变性略微增多，纤维化和细胞增殖增加(图S1H)。88%雄性和43%雌性Prkcif/f; Alb-Cre小鼠的肝脏中均存在HCC，这与雄性HCC更具有侵袭性的特性相一致。相反，所有Prkcif/f小鼠均显示良性肝腺癌(图1J)。Prkcif/f; Alb-Cre小鼠的肝癌表现出广泛的组织学分级，从小梁型和假腺型分化良好到中分化的肝细胞癌，以及与人类临床肝细胞癌相似的低分化肝细胞癌(图1K)。此外，63%雄性和14%雌性Prkcif/f; Alb-Cre小鼠出现肺转移(图1J和1l)。这些发现表明，PKCλ/ι功能对抑制肝癌发展至关重要，与肿瘤组织学分级和PKCλ/ι表达之间的负相关一致(图S1A)。Prkcif/f; Alb-Cre小鼠肝脏中完全没有PKCλ/ι，周围的非肿瘤肝组织(图S1I)和肺转移灶(图S1J)中也没有PKCλ/ι。

与Prkcif/f相比，用DEN/HFD处理的Prkcif/f; Alb-Cre小鼠中血清总胆红素未见增加(图S2A)，提示胆管细胞间未明显失调。同时，在两种喂养条件下，突变型肝脏中很少观察到导管反应(图S2B)。此外，免疫组化分析显示肝细胞谱系标记物HNF4α染色呈阳性，而胆道细胞谱系标记物KRT19染色呈阴性，这与Prkcif/f; Alb-Cre肿瘤为HCC而非肝内胆管癌的观点相一致(图S2C)。对Prkcif/f; Alb-Cre小鼠的免疫微环境分析显示，与对照组相比，B细胞(B220)、T细胞(CD3)、Ly6G或F4/80的免疫群体无差异(图S2D和S2E)。异位淋巴样结构(ELS)的存在是HCC预后不良的因素，通常与慢性炎症有关。然而，没有检测到合适的ELS，只有小的免疫聚集物F4/80+巨噬细胞和Kupffer细胞(图S2F和S2G)。

图1 肝细胞特异性PKCλ/ι的缺失会促进HCC发生。

2. 肝细胞特异性PKCλ/ι的缺失会增加体内氧化磷酸化，氧化应激和NRF2上调

两种基因型肝脏的RNA测序(RNAseq)的GSEA分析显示，在分别喂食RD(图2A-2E)和HFD(图S3A-S3E)的Prkcif/f; Alb-Cre小鼠的肝脏中，OXPHOS、脂肪酸代谢和氧化(FAO)以及ROS相应的信号被富集。Prkcif/f; Alb-Cre小鼠肝脏的上皮-间充质转化(EMT)特征也上调，这与它们的肿瘤发生增加相一致(图2A和S3A)。qPCR证实了这些样本中代表氧化代谢的转录本的上调(图2F)。Prkcif/f; Alb-Cre小鼠血浆酮体水平升高(图2G)，肝脏三酰甘油水平降低(图2H)。从Prkcif/f; Alb-Cre小鼠肝脏分离的肝细胞的耗氧率(OCR)持续升高(图2I和2J)。基因通路分析和NextBio发现“调控基序”，从而确定了PPARα作为肝细胞PKCλ/ι缺陷和OXPHOS代谢程序激活之间的潜在关系(图2K, 2L, S3F和S3G)。

在GSEA分析中，Prkcif/f; Alb-Cre肝脏中富集ROS信号(图2A、2E、S3A和S3E)，与OXPHOS扩增相关的ROS生成一致。两种处理条件下，Prkcif/f; Alb-Cre肝组织的二氢乙二烯染色均显示体内ROS水平升高(图2M、2N、S3H和S3I)，这将导致NRF2的激活。NextBio分析显示，在Prkcif/f; Alb-Cre肝脏中对应于“NFE2L2结合位点基因集”的基因信号上调(图2O)。Prkcif/f; Alb-Cre肝脏显示NRF2的真实靶点Nqo1和其他几个NRF2靶点的表达增加(图2P-2R和S3J)。双IHC染色显示NQO1在肝细胞中上调(图S3K)。在Prkcif/f; Alb-Cre肝脏中，HFD喂养协同上调Nfe2/2 mRNA及其靶基因(图2S和S3L)。在小鼠肝细胞系BNL CL.2 (sgPrkci)中，利用CRISPR/Cas9敲除PKCλ/ι，导致核NRF2水平升高，且NRF2活性升高(图2T-2V)。这些结果证实，肝细胞中PKCλ/ι的缺失导致OXPHOS基因表达程序的激活，这与ROS积累和NRF2活性增加息息相关。

图2 肝细胞特异性PKCλ/ι的缺失导致代谢重编程。

3. PKCλ/ι在OXPHOS调控中的细胞自主性

sgPrkci细胞中OXPHOS基因的上调显示了PKCλ/ι作为OXPHOS负调控因子的细胞自主性(图3A)。CPT1蛋白水平(FAO中的限速酶)在sgPrkci细胞中也升高(图3B)。由于OXPHOS上调，sgPrkci细胞消耗更少的葡萄糖和产生更少的乳酸，而谷氨酰胺消耗没有差异(图S4A-S4C)。重要的是，sgPrkci细胞显示OCR增加，而PPARα抑制剂GW6471可以消除OCR(图3C和3D)。在PKCλ/ι缺陷的人肝癌HepG2细胞中，OCR也以PPARα依赖的方式升高(图S4D-S4F)。

一个关键问题是确定PKCλ/ι调节PPARα活性的机制。之前报道PKCζ是通过直接磷酸化PPARα的上游激活物。因此，PKCλ/ι缺失可能导致PKCζ的上调。事实上，Prkcif/f; Alb-Cre肝脏显示PKCλ/ι缺陷肝细胞中PKCζ表达增加(图3E和3F)。同样，在DihXD3细胞、小鼠HCC细胞系或HepG2细胞中PKCλ/ι的缺失导致PKCζ水平升高(图3G)。接下来，我们将HA-PPARα质粒转染到sgC或sgPrkci细胞中，然后用siRNA敲除PKCζ(由Prkcz基因编码)。HA-PPARα进行免疫沉淀，IB用磷酸化苏氨酸抗体分析。虽然在PKCζ熟练的sgPrkci细胞中PPARα磷酸化增加，但在PKCζ缺乏的sgPrkci细胞中，PPARα磷酸化完全消失(图3H)，这与PKCλ/ι通过PKCζ控制PPARα磷酸化的模型一致。Prkczf/f; Alb-Cre小鼠以预期的孟德尔比率出生，发育正常，肝脏、ALT、ALP或TBil血清水平没有变化(图S4G-S4J)。同样，当接受DEN/HFD喂食时，Prkczf/f; Alb-Cre小鼠表现出与对照组小鼠相似的脂肪变性和肿瘤发生(图S4K-S4P)。这些结果表明，尽管在肝细胞PKCλ/ι丰富的情况下，PKCζ不参与HCC，但其在PKCλ/ι缺失时的上调揭示了其在PPARα激活中的作用。有趣的是，PKCζ沉默降低了sgPrkci BNL CL.2细胞中OCR的增加(图3I-3K)，证实了PKCζ是PKCλ/ι在调控PPARα驱动的OXPHOS中的一个发挥重要功能的步骤。

PKCλ/ι缺乏如何促进OXPHOS的下一步研究使用同位素示踪策略来量化基质对TCA循环的利用。因此，将sgC和sgPrkci BNL CL.2细胞与[U-13C16]棕榈酸盐孵育，柠檬酸的碳标记用于定量FAO(图3L)。与FAO增加相一致的是，sgPrkci细胞表现出较高水平的柠檬酸碳标记(图3M)，表明PKCλ/ι的缺失促进了OXPHOS脂肪酸的碳通量。通过用[U-13C]葡萄糖孵育细胞，我们观察到从头脂肪生成减少(图3N和3O)，而葡萄糖对脂肪生成乙酰辅酶A的贡献没有受到影响(图S4Q)。sgPrkci细胞中脂肪酸水平降低(图3P)。此外，虽然在sgPrkci细胞中[U-12C6]葡萄糖对棕榈酸酯的相对贡献减少(图3O和S4R)，但对TCA循环的贡献增加(图3Q)。这些代谢研究表明，PKCλ/ι的缺失可诱导中枢碳代谢的重编程，促进碳从葡萄糖进入氧化途径。

图3 肝细胞中PKCλ/ι的缺失增强了氧化磷酸化。

4. 肝细胞PKCλ/ι的缺失导致自噬激活

OXPHOS和FAO的底物来源于自噬。与对照组相比，Prkcif/f; Alb-Cre肝脏提取物显示LC3及其脂化形式LC3-II水平升高(图4A)；同时，编码自噬和溶酶体途径组分的基因表达增加(图4B和4C)。电子显微镜和形态测量分析显示，与sgC对照相比，在基础条件下以及在营养缺失的情况下，sgPrkci肝细胞中自噬小泡和自噬溶酶体(AUT)的丰度更高，导致自噬小泡总数增加(图4D-4F)。AUT中自噬小体成熟时自噬空泡的增加与PKCλ/ι缺陷细胞中自噬的高诱导率相一致。由于自噬通量是自噬小体形成和清除的结合，我们通过比较抑制剂处理2和4 h时LC3-II水平的变化来分析自噬小体的生物发生。本研究显示sgPrkci肝细胞LC3-II基础水平较高，在溶酶体蛋白酶抑制剂的作用下LC3-II水平进一步升高，提示自噬通量增强(图4G和4H)。这主要是由于自噬体形成率较高，以及通过溶酶体降解有效清除自噬体所致(图4I)。接下来，我们使用串联双荧光标记的LC3报告基因(mCherry- GFP-LC3)检测自噬通量。与sgC相比，在饥饿条件下，sgPrkci细胞显示LC3阳性的斑点总丰度更高，LC3通量增加(图4J和S5A)。与PKCζ对PPARα激活的依赖性相反，PKCζ的下调并不影响sgPrkci细胞中增强的自噬(图S5B)。这些结果证实了PKCλ/ι是一个独立于PKCζ的自噬负调控因子。

为了研究自噬的机制，我们使用邻近标记生物素法(BioID2)来识别PKCλ/ι的相互作用物(图4K)。鉴定的自噬蛋白包括p62/SQSTM1和MAP1LC3(图4K)。体外表达和内源性蛋白的免疫沉淀证实了LC3和p62是PKCλ/ι的真实结合伙伴(图4L和S5C)。由于p62也通过其LIR结构域与LC3结合，PKCλ/ι与LC3的相互作用可以由p62介导。PKCλ/ι PB1结构域的突变破坏了其与p62的结合，并不影响PKCλ/ι与LC3的相互作用(图S5D和S5E)。这一结果表明，PKCλ/ι直接结合LC3，不依赖于p62。重组蛋白结合实验证实了PKCλ/ι-LC3的直接相互作用(图4M)。PKCλ/ι的催化结构域是其与LC3相互作用的必要因素(图S5D、S5F和S5G)，这表明LC3可能是PKCλ/ι激酶活性的底物。体外检测表明，LC3可被PKCλ/ι直接磷酸化(图4N)，质谱分析鉴定丝氨酸(S) 12为LC3蛋白中唯一的磷酸化位点(图S5H)。ScanSite v4.0软件也预测S12在LC3中是aPKC磷酸化位点(图S5I)。该位点在两种LC3亚型中都是跨物种保守的，在LC3A中是丝氨酸，在LC3B中是苏氨酸(图S5J)。S12也与之前确认的aPKCs一致的底物识别模式一致(图S5J)。体外磷酸化后，IB用磷酸化-S12-LC3抗体，证明S12是LC3中PKCλ/ι的直接真实磷酸化位点(图4N)。当对激酶死亡的PKCλ/ι突变体进行酶促分析时，这种磷酸化被消除(图S5K)。在PKCλ/ι缺陷细胞中，LC3 S12磷酸化减少，同时自噬增加(图4O)。p62与S12A非磷酸化LC3突变体的相互作用强于与LC3 WT的相互作用(图4P)，这与S12磷酸化对LC3功能的负面影响一致。根据报道的含有p62肽的LC3B复合物的结构数据，对LC3A的结构进行建模，可以发现S12磷酸化与天冬氨酸(D) 15产生了破坏稳定的冲突(图4Q)。分子动力学模拟表明，螺旋锚定的D15刚性定位，迫使磷酸化的S12旋转远离蛋白(图4Q)。这一运动导致上游环扭曲，打乱了精氨酸(R) 10和R11与p62结合的定位，这可以解释p62-LC3磷酸化后结合减少的原因。与此一致的是，串联双荧光标记-LC3T12报告基因检测显示，表达LC3S12A突变体的肝细胞形成了更多的自噬小泡，并增强了自噬通量(图4R、4S、S5L和S5M)。这些数据表明，肝细胞中PKCλ/ι缺失可促进两条协同途径。一种导致维持OXPHOS的自噬增加，另一种转录重组肝细胞通过PPARα激活OXPHOS。事实上，用BafA1治疗sgPrkci细胞会减少在sgC细胞中发现的OCR水平(图4T-4V)。与自噬-OXPHOS-ROS-NRF2轴的存在一致，BafA1处理也抑制了NRF2的激活(图4W)。

图4 肝细胞PKCλ/ι的缺失可增强自噬通量。

5. OXPHOS、ROS和NRF2的增加对肝细胞增殖、凋亡和癌细胞侵袭至关重要

与PKCλ/ι的细胞自主抗肿瘤功能一致的是，sgPrkci BNL CL.2肝细胞比对照组增殖更多(图S6A)。在HepG2细胞中也得到了类似的结果，也显示出增强的成球活性(图S6B-S6D)。在sgPrkci BNL CL.2肝细胞中用etomoxir(一种CPT1的抑制剂)或siRNA诱导Cpt1a沉默，可导致与sgC细胞相当的生长抑制水平(图5A和5B)。使用PPARα的拮抗剂GW6471治疗，在体外和体内完全抑制了肝细胞的增殖(图5C-5E)，这表明PPARα和随后OXPHOS的上调对于PKCλ/ι缺陷驱动的细胞生长至关重要。同样，GW6471处理也使sgPRKCI HepG2细胞的成球能力减弱(图5F和5G)。有趣的是，DihXD3细胞中PKCλ/ι的缺失显著增加了EMT(图S6E-S6H)。使用氯喹(一种自噬抑制剂)或GW6471处理，可消除PKCλ/ι缺陷DihXD3细胞的侵袭性表型(图5H和5K)。为了确定PKCλ/ι缺乏引起的EMT表型在体内的相关性，我们通过尾静脉注射将PKCλ/ι缺失或WT DihXD3细胞移植到NSG小鼠中(图5L)。虽然sgPrkci和sgC DihXD3细胞都发生了肺转移(图5M和5N)，但根据原发肿瘤的大小校正后，sgPrkci细胞的转移潜能明显高于sgC细胞(图5O-5R)。在DihXD3肝和肺转移中，PKCλ/ι表达丢失(图5S)。此外，在人HCC细胞系SK-HEP-1中PRKCI的缺失也在体外诱导了类似的侵袭性表型(图S6I-S6K)，以及体内肺转移增加(图S6L-S6Q)。这些结果表明，在肝癌细胞中，PKCλ/ι的缺失通过上调OXPHOS代谢程序，导致细胞增殖、球状形成和侵袭性的细胞自主增加。

ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)或丁基羟基氨基磺酸(BHA)对sgPrkci BNL CL.2细胞增殖的抑制作用与sgC细胞相似(图5T和5U)。与Prkcif/f; Alb-Cre肝脏一样，sgPrkci细胞凋亡增加(图5V)。NAC或BHA抑制了sgPrkci细胞中caspase-3的活性(图5W和5X)，这表明PKCλ/ι缺陷的肝细胞增殖能力增强的原因可能是OXPHOS和ROS水平升高。细胞ROS高水平的一个重要结果是NRF2信号通路的激活。Nfe2l2的下调降低了sgPrkci细胞增加的增殖能力(图5Y)。因此，NRF2是PKCλ/ι缺陷肝细胞超增殖表型的关键中介。此外，NRF2的缺失不仅导致细胞增殖下降，还导致caspase-3活性增强(图5Z)，这可能与NRF2缺失的sgPrkci细胞的表型有关。

图5 PKCλ/ι的缺失增强了肝癌细胞的侵袭性表型。

6. PKCλ/ι在HCC中的细胞非自主抑癌作用

肝细胞中PKCλ/ι的缺失不仅可能驱动肝细胞自主增殖，还可能创建肝脏致瘤前的微环境，这一可能性在两个体内实验模型中得到了解决。首先，我们通过尾静脉注射将同基因小鼠DihXD3 HCC细胞移植到Prkcif/f或Prkcif/f; Alb-Cre小鼠中(图6A)。为了确定NRF2在这一过程中的作用，我们还杂交了Prkcif/f; Alb-Cre小鼠与Nf2l2 KO小鼠产生Prkcif/f; Alb-Cre; Nf2l2+/_。Prkcif/f; Alb-Cre小鼠比Prkcif/f对照小鼠具有明显更高的肿瘤负荷和大规模的血腥腹水，这Prkcif/f; Alb-Cre; Nf2l2+/_小鼠中可以得到完全恢复(图6B-6E)。第二种模型是将相同的HCC细胞直接植入Prkcif/f或Prkcif/f; Alb-Cre小鼠肝脏，HFD喂养4周(图6F)。与我们的假设一致，在HFD处理的Prkcif/f; Alb-Cre小鼠中，DihXD3细胞比同等处理的Prkcif/f小鼠产生更多的肝脏原发肿瘤和肺转移病灶(图6G-6J)。这些结果强烈表明，PKCλ/ι缺陷的肝细胞不仅是更自主的致瘤细胞，而且还能创造一个肝脏微环境，以NRF2依赖的方式促进更高水平的恶性肿瘤。

图6 PKCλ/ι缺失在非肿瘤性肝组织中产生促肿瘤发生的微环境。

7. PKCλ/ι在肝癌中的人类相关性

在小鼠肝脏肿瘤中观察到的肿瘤组织学分级与PKCλ/ι表达呈负相关(图S1A)，在使用PKCλ/ι特异性抗体的免疫组化分析的人类HCC临床标本中也可以看到。本分析包括271个切除的样本，结果显示在低分化人HCC中PKCλ/ι的表达显著降低(图7A和7B)。此外，本研究中的小鼠研究表明，肝细胞中PKCλ/ι的缺失创造了肝脏致瘤前的微环境(图6)。为了在人类患者中验证这些观察结果，我们首先研究了周围非肿瘤肝组织中的低PKCλ/ι表达是否构成恶性肿瘤发生的危险因素。研究了139例HCC患者的手术切除组织。有趣的是，单因素和多因素logistic回归分析均显示，非肿瘤肝组织中PKCλ/ι低表达(弱或无染色信号)是低分化HCC的重要预测因子(图7C)。进一步对82例接受手术的患者进行转录组数据分析，非肿瘤区PKCλ/ι低表达与晚期复发显著相关(图7D)。这些发现支持了我们在小鼠中进行的相关研究，并证实了非肿瘤肝细胞中PKCλ/ι的丢失对创建有利于肝癌的微环境具有决定性作用。本文报道的PKCλ/ι突变小鼠研究中PPARα-OXPHOS-ROS-NRF2轴的上调和自噬的激活在人类患者中也得到了验证。因此，对TCGA数据集的HCC患者RNA-seq数据进行的in-silico分析显示，肝组织中PKCλ/ι的表达与对应的氧化微环境、自噬、NRF2和PPARα的基因信号之间存在显著的负相关(图7E-7H)。

图7 人肝组织中PKCλ/ι低表达是晚期HCC复发的危险因素。

讨论

该研究中，作者表明肝细胞中PKCλ/ι的基因失活导致了代谢变化，而代谢变化对原发性HCC肿瘤的进展、转移能力的增强以及创建有利于癌症的肝脏微环境至关重要。与之前报道的PKCλ/ι在白血病和肺癌中的促癌作用相反，其在肝细胞中的作用是通过调节自噬来抑制肿瘤发生。尽管抑制肝细胞自噬似乎促进了肝癌的发生，但在PKCλ/ι缺乏的情况下，自噬的增加无疑有助于增强PKCλ/ι缺乏的肝细胞和肝癌细胞的氧化代谢。这种代谢重编程对于PKCλ/ι缺陷转化肝细胞中三个主要癌症特征的上调至关重要，即增殖、球状形成和EMT/侵袭，共同驱动这些突变肝癌细胞的转移潜能增强。重要的是，我们还揭示了PKCλ/ι抑制自噬的分子机制。包括PKCλ/ι磷酸化LC3的S12位点，这削弱了LC3与p62之间的相互作用。这揭示了之前未被发现的p62-PKCλ/ι-LC3三元复合物的存在，通过PKCλ/ι通过各自的PB1结构域与p62结合，调节LC3与p62的LIR结构域的相互作用，这被PKCλ/ι对LC3的结构性磷酸化所抑制。因此，我们的模型确定，在HCC发展期间，肝细胞中PKCλ/ι水平的降低引发自噬，维持氧化代谢，这是肿瘤发展所必需的。然而，尽管自噬的激活是由PKCλ/ι缺陷激活的致瘤途径中必需的事件，但它可能还不够。为了确保肝癌细胞这一代谢标志的效率，PKCλ/ι的缺失还会通过PPARα的激活上调氧化代谢程序。通过这种方式，PKCλ/ι控制氧化过程中的两个关键武器。一方面调节转录机制，为肝细胞提供必要的氧化网络，另一方面调节自噬，通过提供氧化的营养物质维持氧化功能。

PKCλ/ι与PPARα和自噬的联系对于满足肝癌细胞的代谢需求和活性氧的产生至关重要。ROS导致PKCλ/ι缺陷的肝细胞和肝癌细胞死亡，并极有可能促进代偿性增殖。该系统中升高的ROS水平有助于激活NRF2，通过上调ROS清除剂，将ROS水平保持在可容忍的阈值以下，从而允许细胞增殖而不会导致不可容忍的细胞死亡水平。在这些条件下，NRF2的第二个作用是通过释放其促生长机制来促进细胞自主增殖。在这方面，NRF2已被证明实际上影响癌症的所有特征。然而，除了作为致瘤前转录因子的这些细胞自主的双重作用外，NRF2对于PKCλ/ι在肝脏肿瘤微环境中的细胞非自主作用也是至关重要的。因此NRF2是自噬增强条件下上皮细胞和肿瘤微环境中的一个重要成分。

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