编译：思越，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
m6A甲基化修饰与多种肿瘤的发生发展有关，但是在骨肉瘤中的潜在作用及其机制尚不清楚。本研究通过RNA测序和甲基化测序，证实了癌基因WTAP通过m6A修饰抑制靶基因HMBOX1表达，减弱了对骨肉瘤生长与转移的抑制作用，并在体内与体外进行了验证，以阐明m6A修饰在骨肉瘤进展中的关键作用，为骨肉瘤的治疗提供新的见解。
原名：WTAP promotes osteosarcoma tumorigenesis by repressing HMBOX1 expression in an m6A-dependent manner
译名：WTAP通过m6A依赖性抑制HMBOX1表达促进成骨肉瘤的形成
期刊：Cell Death & Disease
IF：6.304
发表日期：2020年8月19日
通讯作者：苗惊雷
通讯作者单位：中南大学湘雅三医院
DOI号：10.1038/s41419-020-02847-6
作者首先通过公共数据库检测m6A相关基因的表达差异，并选择writer WTAP进行后续分析。接下来利用shRNA慢病毒敲除WTAP基因，使用CCK8和集落形成实验探究骨肉瘤细胞的增殖能力变化，通过细胞侵袭实验和划痕实验证明侵袭和迁移能力变化。通过转录组测序来阐明WTAP敲除细胞的转录改变，MeRIP-seq鉴定m6A修饰基因，并整合公共CLIP-seq数据，建立了RNA-seq，MeRIP-seq和CLIP-seq的基因重叠，通过RT-qpcr鉴定出HMBOX1是上调最明显的基因。通过m6A斑点印迹法和RNA甲基化定量法检测WTAP敲除后的m6A整体水平。接着作者构建敲除m6A结合位点的HMBOX1突变体进行了荧光素酶报告基因鉴定。最后在体内和体外实验证明了HMBOX1参与WTAP介导的骨肉瘤增殖和转移。为了探究m6A在骨肉瘤中的作用，作者通过公共数据(GSE87624)检测了17个m6A相关基因在骨肉瘤组织和正常骨组织中的表达水平，发现WTAP、RBM15、YTHDF1和YTHDF2在肿瘤组织中的表达与对照存在差异（图1a）。由于m6A writer在癌症进展中起到重要作用，于是选择WTAP进行下一步分析。接着，作者检测了104个癌症样本与癌旁样本（TXHCSU）WTAP的表达，结果显示WTAP在肿瘤组织的表达增高（图1b），蛋白水平也明显上调（图1c），Kaplan-Meier分析显示，WTAP表达水平越高的患者生存率越低（图1d）。通过单因素和多因素cox分析，发现WTAP的过表达是OS患者总生存率的独立预后因素（图1e），使用诺模图预测患者的总生存率，校正曲线显示，患者的实际存活率和诺模图预测结果具有较好的一致性（图1f）。此外，在骨肉瘤细胞中WTAP也是高表达的。综上所述，WTAP在骨肉瘤中高表达，并与其不良预后相关。
作者接下来利用shRNA慢病毒(shWTAP#1和shWTAP#2)建立了WTAP基因敲除的骨肉瘤细胞，使WTAP表达下调（图2a），并分析WTAP在骨肉瘤细胞迁移、侵袭和增殖中的作用。CCK8和集落形成实验表明，WTAP的缺乏抑制了两种细胞系（HOS，U2OS）的增殖能力（图2b，c），并通过细胞侵袭实验和划痕实验证明沉默WTAP显著降低骨肉瘤的侵袭和迁移能力（图2d，e）。综上所述，WTAP在骨肉瘤中促进了细胞增殖、迁移和侵袭。
3.HMBOX1被认为是骨肉瘤中WTAP的潜在靶点为了了解WTAP调控骨肉瘤进展的潜在机制，作者通过转录组测序来阐明WTAP敲除细胞的转录改变。WTAP失活后，层次聚类显示共有521个差异基因下调，624个差异基因上调。GO分析显示差异基因富集于中性粒细胞活化、细胞周期等过程，KEGG分析表明差异基因附近与代谢相关信号通路。通过MeRIP-seq鉴定出546个m6A修饰基因。为了缩小下游靶点的范围，作者整合了GEO的CLIP-seq数据（GSE46705），建立了RNA-seq，MeRIP-seq和CLIP-seq的基因重叠（图3a）。韦恩图共鉴定出6个基因，包括2个上调基因（SLC3A2，CASP7），4个下调基因（ABR，HS6ST1，CD59和HMBOX1），并在GEO数据（GSE87624）以及TXHCSU肿瘤组织中验证这些基因的表达趋势。接着，作者使用RT-qPCR来评估WTAP对每个候选基因的影响。其中，在WTAP沉默后，HMBOX1的上调最为明显（图3b），并通过分析证实了HMBOX1蛋白水平的升高（图3c）。接着，作者分析了WTAP和HMBOX1在GEO数据（GSE87624）和TXHCSU中表达的关系，发现HMBOX1的表达与WTAP的表达呈负相关，且在TXHCSU中HMBOX1的表达随着肿瘤体积和转移而降低，生存分析表明，HMBOX1水平低的患者具有更低的总体生存率（图3e）。通过单变量和多变量分析表明，HMBOX1是骨肉瘤患者总存活率的独立预后因素（图3f）。此外，HMBOX1在骨肉瘤细胞系（SJSA-1，MG-63，HOS，U2OS和143B）中的表达低于在人成骨细胞系（hFOB1.19）中的表达(图3g)。综上所述，HMBOX1是WTAP的一个潜在靶点，并与骨肉瘤患者的不良预后有关。
4.WTAP通过m6A修饰调节骨肉瘤HMBOX1的表达为了确定HMBOX1的m6A修饰是否通过WTAP介导，作者使用m6A斑点印迹法和RNA甲基化定量法，来检测阴性对照组和稳定的WTAP敲低组的m6A的整体水平。结果表明，随着WTAP的缺失，两株骨肉瘤细胞系m6A水平显著降低（图4a）。此外，通过MeRIP-qPCR检测m6A在HMBOX1的富集情况。发现未敲除WTAP的细胞中，m6A特异性抗体较强地富集了HMBOX1转录本（图4b），并通过在线网站SRAMP (http://www.cuilab.cn/sramp)预测出HMBOX1的3'UTR处存在3个高置信度的m6A位点。作者用野生型（WT）和3个突变体（Mut）进行了荧光素酶报告基因鉴定，对于Mut报告基因，预测m6A位点的几个腺苷碱基（A）被胞嘧啶碱基（C）取代，以消除m6A甲基化的影响，而WT报告基因包含完整的m6A位点（图4c）。结果发现，WT组的荧光素酶活性在WTAP敲低作用下显著增强，而Mut组的荧光素酶活性对WTAP沉默的影响具有一定的抵抗作用（图4d），说明HMBOX1的调控受到WTAP诱导的m6A修饰的控制。此外，作者还研究了reader YTHDF2在骨肉瘤的表达和HMBOX1表达的作用。在GEO数据（GSE87624）、骨肉瘤组织和细胞中观察到YTHDF2的显著上调（图4e），但未发现WTAP沉默对HMBOX1的表达没有影响（图4f），说明WTAP通过不依赖YTHDF2的方式介导m6A以调节HMBOX1的表达。
图4 HMBOX1与WTAP表达呈负相关，并与骨肉瘤不良预后有关5.HMBOX1参与WTAP介导的骨肉瘤增殖和转移接着作者探究了HMBOX1是否参与WTAP介导的骨肉瘤增殖和转移。通过敲低WTAP后，HMBOX1表达明显增加；而敲低HMBOX1显著降低了WTAP依赖性（图5a）。CCK8结果表明，WTAP沉默的细胞中敲低HMBOX1增加了细胞的增殖水平（图5b），在克隆形成实验中沉默HMBOX1也减轻了shWTAP介导的细胞增殖抑制（图5c），并在细胞侵袭实验和划痕实验中观察到同样的效果（图5d，e）。此外，沉默WTAP后，敲低HMBOX1抑制了骨肉瘤细胞间充质标志物(钙粘蛋白和波形蛋白)的表达，并诱导了上皮标志物E-钙粘蛋白的表达（图5f）。上述结果表明，WTAP 通过抑制 HMBOX1的表达促进骨肉瘤细胞的增殖和转移。接着，作者通过诱导小鼠皮下骨肉瘤模型、原位异种移植瘤模型和尾静脉转移模型，验证HMBOX1在体内的作用。沉默WTAP显著上调皮下骨肉瘤组织中HMBOX1的表达水平（图6a），显著降低肿瘤提及和重量，并通过降低HMBOX1的表达实现表型逆转（图6b）。接着作者借助GFP标记构建了原位异种移植瘤模型。生物发光成像显示，WTAP基因敲除降低了U2OS细胞的原位增殖，而沉默HMBOX1减轻了对细胞增殖的抑制作用(图6C)。为了进一步检测WTAP和 HMBOX1对骨肉瘤体内转移能力的影响，生物法光成像显示沉默HMBOX1减轻了沉默WTAP后对骨肉瘤转移的抑制作用(图6d)。综上所述，HMBOX1参与WTAP介导的骨肉瘤生长和转移。
图5 HMBOX1作为肿瘤抑制因子参与WTAP介导的骨肉瘤进展
图6 在体内沉默HMBOX1可减弱shWTAP对骨肉瘤生长和转移的抑制6.WTAP/HMBOX1通过PI3K/AKT途径调控骨肉瘤增殖和转移KEGG结果表明，PI3K / AKT途径可以受WTAP调控，而PI3K / AKT信号通路可促进骨肉瘤等多种癌症的生长，迁移和侵袭。通过沉默WTAP，磷酸化PI3K/AKT被显著抑制，而沉默HMBOX1后显著减弱了这种抑制作用（图7a），此外，使用LY294002对PI3K/AKT进行抑制后，显著降低shHMBOX1诱导的细胞增殖、迁移和侵袭（图7b，c）。总之，WTAP/HMBOX1可通过PI3K/AKT途径调控骨肉瘤的增殖和转移(图8)。
图7 WTAP/HMBOX1通过PI3K/AKT通路参与骨肉瘤的发生发展
作者通过公共数据库检测m6A相关基因的表达差异，并选择writer WTAP进行后续分析，并发现WTAP可以调控骨肉瘤细胞的增殖和迁移。并通过转录组测序和MeRIP-seq找出m6A修饰基因HMBOX1。在确定WTAP的沉默与表达影响m6A的整体水平后，通过构建HMBOX1的m6A结合位点突变体证明WTAP调控HMBOX1的表达，并通过体内和体外实验证明HMBOX1表达可以受到WTAP的调控，且HMBOX1参与了骨肉瘤细胞生长和转移过程。整篇思路是十分清晰的，此外作者通过KEGG分析发现PI3K / AKT途径可以受WTAP调控，WTAP/HMBOX1通过PI3K/AKT途径调控骨肉瘤生长和转移，但是对于HMBOX1如何调控PI3K/AKT通路作者没有继续深入研究。总之，本文发现骨肉瘤中WTAP升高与不良的临床结果相关，并可作为骨肉瘤患者的独立预后因素。WTAP通过以m6A依赖的方式调节HMBOX1的表达，促进骨肉瘤的增殖和转移，并部分通过PI3K/AKT途径，提示WTAP/HMBOX1可能是一个潜在的骨肉瘤治疗靶点。
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