科研 | Cell：癌症中环状RNA的全景图
编译：Tigobin，编辑：十九、江舜尧。
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环状RNA(CircRNAs)是一类有趣的RNA，由于其共价封闭结构、高稳定性和在基因调控中的潜在作用而成为一类有趣的RNA。本研究中，研究者使用外显子捕获RNA测序方案来检测和表征超过2000个癌症样本中的CircRNAs。与Ribo-Zero和RNase R相比，捕获测序显著增强了CircRNA的富集，并保留了准确的环线比。利用捕获测序，研究者建立了迄今为止最全面的CircRNA物种目录：MiOncoCirc，这是第一个主要由直接在肿瘤组织中检测到的CircRNA组成的数据库。使用MiOncoCirc，研究者确定了候选CircRNA作为前列腺癌的生物标志物，并能够检测到尿中的CircRNA。研究者进一步检测到一类新的循环转录本，称为通读CircRNAs，它涉及来自不同基因的外显子。MiOncoCirc将成为开发CircRNAs的宝贵资源，使其成为各种癌症的诊断或治疗目标。
论文ID
原名：The Landscape of Circular RNA in Cancer
译名：癌症中环状RNA的全景图
期刊：Cell
IF：36.21（2018影响因子）
发表时间：2019年
通讯作者：Arul M. Chinnaiyan
通讯作者单位：University of Michigan
DOI号：doi.org/10.1016/j.cell.2018.12.021
实验设计
研究者使用外显子捕获RNA测序方案来检测和表征超过2000个癌症样本中的CircRNAs。与Ribo-Zero和RNase R相比，捕获测序显著增强了CircRNA的富集，并保留了准确的环线比。利用捕获测序，研究者建立了迄今为止最全面的CircRNA物种目录：MiOncoCirc，这是第一个主要由直接在肿瘤组织中检测到的CircRNA组成的数据库。使用MiOncoCirc，研究者确定了候选CircRNA作为前列腺癌的生物标志物，并能够检测到尿中的CircRNA。研究者进一步检测到一类新的循环转录本，称为通读CircRNAs，它涉及来自不同基因的外显子。
图片摘要
结果
1. 外显子组捕获RNA-Seq是一种分析CircRNA的有效方法。
研究者验证了外显子捕获RNA-Seq与Ribo-Zero测序的性能，Ribo-Zero测序是检测CircRNA最常用的高通量方法。与RiboZero相比，捕获测序在一组细胞系和冰冻组织中持续检测到每个文库中更多的CircRNA物种(图1A)。此外，使用VCaP前列腺癌细胞，研究者验证了Ribo-Zero文库中存在的大多数CircRNA物种也存在于该细胞系的匹配捕获文库中(图1B)。与在Ribo-Zero中一样，捕获时保留了环形到线性的部分(图1C)。此外，在RNaseR后处理中，捕获测序产生了所有CircRNA物种的总体环线比升高(图1D)，从而证实研究者的捕获测序方法检测到了真正的环状分子，而不是该方案固有的潜在连接伪像。
图1.外显子捕获RNA-SEQ方法检测CircRNA的有效性。(A)与匹配的Ribo-Zero样本相比，捕获转录组测序在来自临床样本和细胞系的六对文库中始终检测到更多的环状RNA(CircRNA)。(B)在VCaP细胞系文库中，外显子捕获平台和Ribo-Zero测序平台上检测到的CircRNA物种有显著重叠。(C)在VCaP中，捕获测序保留了CircRNA相对于其线性对应物的相对丰度，与Ribo-Zero文库相当(Spearman秩相关r=0.65)(见STAR方法)。(D)从MiOncoCirc渠道中调用的反向剪接事件在RNase R处理后在VCaP和22Rv1细胞系中升高，进一步证实它们是真实的CircRNA，而不是连接人工产物。
2. 用外显子捕抓RNA-Seq构建MiOncoCirc纲要。
此处报道的MiOncoCirc版本包括868个样品，这些样品是从先前发布的临床样品和癌细胞系以及合并的正常组织的数据集中获得的（图2A）。图2B和STAR方法中详细介绍了用于创建MiOncoCirc的方案和生物信息学渠道。有关CircRNAs和RT-CircRNAs的信息可以在MiOncoCirc网站上找到，该网站还可以查询和下载不同癌症类型的CircRNA丰度及其亲本基因的表达(图2C；STAR方法)。
图2. MiOncoCirc纲要的构建和概述。（A）包括来自先前发布的数据集以及细胞系面板和正常组织的868个高深度，双末端RNA-seq样本。（B）外显子组捕获RNA-seq方案和用于创建MiOncoCirc的生物信息学渠道。（C）MiOncoCirc是一个在线数据库，可以查询和下载不同组织中circRNA的丰度。
3. 微小肿瘤循环中CircRNAs的特征。
除了CircBase提供的物种之外，MiOncoCirc还发现了相当数量的CircRNA物种，CircBase是不同来源的CircRNA纲要。为了分析重叠，研究者首先使用了一个严格的截止点，它只包括来自数据集的至少五个不同样本中出现的CircRNA。使用这一标准，MiOncoCirc和CircBase在循环转录本(图3A)和亲本基因方面显著重叠。通过进一步研究MiOncoCirc中的CircRNA物种，研究者发现产生CircRNA的基因倾向于形成多个环状异构体。环状异构体的数量与每个基因的外显子数量成比例增加(图3B)。研究者进一步确定，亲本基因的平均丰度与其相关的CircRNA的平均丰度只有微弱的相关性(图3C)。此外，在所有868个样本中以及两个样本组（前列腺癌和乳腺癌）中，circRNA及其亲本表达的Spearman等级相关性都很低（图3D）。研究者还在MiOncoCirc中发现了CircRNAs的一个子集，它可以在90%的样本中持续检测到，并且丰度高于所有CircRNAs的中位数（图3E）。从这一基因子集产生的CircRNA的特征是侧翼内含子明显更长(图3F)，这些内含子比丰度较低的CircRNA侧翼的内含子含有更多的重复元件。长的侧翼内含子可能含有更多的促进循环的重复和反向互补元件，被发现是环状RNA生物发生的标志。事实上，即使是在研究者的纲要中丰度“低”的那类CircRNA也比全基因组范围内的所有内含子表现出明显更长的侧翼内含子和更多的重复元件(图3F)。
图3. MiOncoCirc中circRNA的特征以及与表达相关的特性。（A）MiOncoCirc和CircBase中circRNA种类的重叠很明显。此比较仅包括出现在五个或更多样本中的高置信度circRNA。（B）基因可以形成多个circRNA转录物。环状转录物的数量与每个基因的外显子数量成比例地增加。circRNA丰度的平均表达与亲本表达的平均表达（在FPKM中）。（C）亲本基因表达分为50个步长区。总体而言，步长区均值没有差异。（D）在所有样本(灰色)、前列腺癌(PRAD，蓝色)和乳腺癌(BRCA，红色)中，CircRNA丰度与其同源亲本基因表达之间的Spearman等级相关分布。总体而言，相关性很低(所有中位数均<0.28)。(E)环状RNA丰度与样品成分的关系(%)。在超过90%的样本中检测到一小部分CircRNA(由589个基因产生的CircRNAs<2%，标记为“高”)。(F)与其余98%的CircRNA相比，这些“高”的CircRNA两侧的内含子要长得多。包括全基因组内含子作为对照。
4. rt-circRNA的流行及其特征。
如果没有通过综合临床测序方法获得的匹配的全基因组测序(WGS)和全外显子组测序(WES)的基因组信息，rt-CircRNAs看起来会类似于RNA-seq中串联复制产生的线性转录本(图4A和4B)。rt-CircRNAs还展示了典型CircRNAs的基因组商标，因为它们的两侧有更长的内含子(图4C)和含有更多重复元件(图4D)。这些涉及两个基因的反向剪接读物中的一些通常在不同的癌症类型中发现（图4E），甚至在正常组织中或在具有正常拷贝数（二倍体）亲本基因的样品中检测到，这进一步表明它们是真正的常见转录组而不是罕见的基因组事件。为了通过定量逆转录酶PCR（qRT-PCR）进一步通过实验验证此类通读转录本已被环化，研究者搜索了在细胞系中表达的转录本，并选择了跨越两个相邻基因TTTY15和USP9Y的反向剪接事件，在Y染色体上相距不到9kb，并且在几个前列腺癌组织样本中被检测到（图4F）。通过qRT-PCR在LNCaP前列腺癌细胞中检测到涉及TTTY15外显子3的向外引物和USP9Y外显子3的产物，以及涉及同一对外显子的向内引物的产物（请参见STAR方法）。但是，只有向外扩增的产物才对RNase R降解具有抗性（图4F），并且USP9Y和TTTY15的反向剪接外显子-外显子连接已通过Sanger测序验证，从而确认靶标是环状分子。
图4.鉴定新型rt-circRNA物种。（A）示意图显示，涉及两个基因的基因组串联重复和circRNA在配对末端RNA-seq中可能看起来相似。（B）示意图描绘了可以从两个相邻基因及其基因组特征产生的循环通读事件。(C)rt-CircRNA侧翼的内含子比全基因组内含子长。（D） rt-circRNAs侧翼的内含子比全基因组的内含子含有更多的重复成分。(E)在研究者的纲要中，前30个最丰富的反向剪接事件涉及邻近基因的频率和分布。(F)选择涉及TTTY15的外显子3和USP9Y的外显子3的循环通读事件在LNCaP细胞中进行验证。在RNaseR处理后，只有外向引物的qRT-PCR产物对外切核糖核酸酶降解具有抗性(见STAR方法)。
5. circRNA在癌症中的特性。
基于这些分析，研究者确定在纲要中CircRNA的基因可以分为三类：组织特异性(n=895)，非组织特异性(n=2，329)和普遍存在(n=1，469)(图5A)。为了表征CircRNAs在肿瘤和正常细胞之间的表达模式是否有所不同，研究者对25对匹配的肿瘤和局限性原发性前列腺癌(PRAD)正常细胞的CircRNAs进行了差异丰度分析(图5B)。在显示癌症与正常相比丰度不同(n=652)的循环转录本中，大多数(n=629)在癌症中表达下调(图5C)。虽然一些CircRNA的下调可以解释为亲本基因的下调(图5C)，但在前列腺癌中也有丰度相对较低的CircRNA，而亲本基因的表达没有明显的变化(图5C)。在研究者的25对配对的正常人和PRAD中，CircRNA总丰度与MKI67和PCNA的表达以及一组细胞周期进展基因(如MCM10、TOP2A、KIAA0101和NUSAP1)呈一致的负相关，这些基因的mRNA水平已被用作前列腺癌的增殖标志物(图5D)。神经内分泌前列腺癌(NEPC)是一种罕见的侵袭性前列腺癌亚型，可由PRAD的激素后治疗引起，预后不良。研究者的8例NEPC病例均以神经内分泌标志物(如SYP、CHGA、CHGB、NCAM1、ENO2、ASCL1、MYCN和AURKA)上调和AR信号通路基因(如AR、AMACR、KLK3、KLK2、FKBP5和PSCA)下调为特征(图6A)。然后，研究者进行了CircRNA差异表达分析(图6B)，发现了34个上调和48个下调的CircRNA，有统计学意义(p<0.01)。在NEPC中，最显著的上调和下调的CircRNAs分别是CIRC-AURKA和CircAMACR(图6C)。这一发现与AURKA和AMACR亲本基因表达的变化一致(图6A)。研究者在RNase R处理的神经内分泌细胞系NCI-H660中进行了qRT-PCR，证实CIRC-AURKA是从外显子6反剪接到外显子3产生的(图6D)。最后，研究者证实CIRC-AURKA在NEPC细胞系NCI-H660中的表达高于在非NEPC前列腺细胞系LNCaP和VCaP中的表达，这一结果与其亲本基因的表达一致(图6E)。
图5.CircRNAs在癌症中的表达模式和特征。(A)可以产生CircRNA的基因的组织特异性热图，如MiOncoCirc纲要中的17个癌症队列所示。如果一个基因在任何给定谱系的超过30%的样本中产生了至少一个高置信度CircRNA，那么它就被认为是一致检测到的(参见STAR方法)。(B)25对匹配的正常前列腺癌和局限性前列腺癌CircRNA丰度的火山图。(C)CircRNA的对数折叠变化(Fc)与线性表达的对数Fc的相关性。再一次，CircRNA丰度总体上被下调。根据线性折叠变化和环形折叠变化之间的关系，研究者进一步将基因分组。第一组(红色)是在癌症中上调的CircRNA，因为它们的亲本基因上调了。第2组(紫色)是那些在癌症中表达下调的CircRNA，因为它们的亲本基因也下调了。然而，在癌症中有一组CircRNAs(第3组，蓝色)表达下调，而父母基因的表达没有相应的变化。(D)总CircRNA与FPKM计算的前列腺癌mRNA增殖标志物相关(MCM10、TOP2A、MKI67、PCNA、KIAA0101和NUSAP1)。点的大小和色标表示成对Spearman等级相关的值。
图6.前列腺神经内分泌中差异的CircRNAs。(A)与去势抗性前列腺癌(CRPC)病例相比，研究者队列中的NEPC病例(根据病理评估的细胞形态学分类)均以神经内分泌标志物(SYP、CHGA、CHGB、NCAM1、ENO2、ASCL1、MYCN和AURKA)上调和AR信号通路基因(AR、AMACR、KLK3、KLK2、FKBP5和PSCA)下调为特征。(B)NEPC组34例上调、48例下调的CircRNA热图与CRPC组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。(C)NEPC与CRPC相比，CircRNA上调最显著的是CIRC-AURKA，下调最显著的是Circ-AMACR。(D)RNaseR处理的NEPC细胞株NCI-H660中AURKA的外向引物(从外显子6到外显子3反向剪接)的qRT-PCR证实了该分子的环状结构。(E)前列腺癌细胞系中环状和线状AURKA的qRT-PCR。
6.前列腺癌细胞CircRNA的稳定性及前列腺癌患者尿液中CircRNA的检测。
所有测试的CircRNA物种都表现出对外切核糖核酸酶的抗性，因此明显比它们的线性对应物种更稳定(图7A)。在放线菌素D处理后0、2、4、8和24小时收获的LNCaP细胞中，CircRNA水平升高，而mRNA水平下降(图7B)，表明环状转录物具有相对较高的稳定性。为了确定CircRNA在生物样品中是否比它们的同源线性RNA更稳定，研究者分析了人血浆中CircRNA的稳定性。VCaP RNAs在血浆中孵育，以模拟循环RNA的环境。事实上，根据选定候选者的环状转录本与线性转录本的比率进行评估，CircRNA在孵育后在血浆中比线性RNA更稳定(图7C)。此外，研究者建立了三个带有外显子捕获RNA-seq的文库，并在前列腺癌患者的尿样中检测到1092个CircRNAs，它们与MiOncoCirc汇编中PRAD组织样本中鉴定的CircRNAs完全重叠(图7D)。
图7. circRNA比同源线性转录本更稳定，可以在前列腺癌患者的尿液样本中检测到。（A）与线性对应物相比，circRNAs对RNase R降解具有抗性。（B）在LNCaP细胞中，放线菌素D抑制转录后，线性转录本比相应的环形转录本降解更快。(C)在血浆中孵育VCaP RNAs后，CircRNAs的环线比随时间增加。(D)用外显子组捕获RNA-seq法检测3例前列腺癌患者尿液中的CircRNAs。这些CircRNAs与从MiOncoCirc队列中发现的前列腺癌组织中发现的CircRNAs有很大重叠。
结论
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