浅析动物刺激诱发痛行为学检测实验方法（1）
疼痛研究的最终目的是寻找有效镇痛手段。目前临床治疗方法不能充分控制顽固性疼痛，主要归 结于疼痛的机制仍不十分清楚，对实验室动物痛行为学进行研究有助于揭示疼痛的相关机制。经典刺激诱发 痛行为学检测，如 von Frey 痛阈实验、甩尾实验、热板实验、哈格里夫斯实验等，已用于大鼠和小鼠动物研究多 年，且在检测镇痛效果方面存在一定的缺陷和不足，急需新的可靠的行为学检测助力痛觉机制研究和镇痛策略 研发。本文对动物痛行为学检测的最新研究进展进行综述，重点介绍了 8 种检测方法: 鬼脸量表、自主行为、转 轮跑步行为、挖洞行为、筑巢行为、家庭笼监控、步态分析以及条件性位置偏爱/厌恶。每种检测方法均给出其优缺点，以帮助研究者选择最合适的行为学检测方法。
1、经典刺激诱发痛行为学检测的局限性
以大鼠和小鼠为研究对象的痛行为学检测已有上百年 历史，最早可追溯到 1869 年即 150 年前的 von Frey 痛阈实验。最常用的还有 1941 年的甩尾实验( tail flick)、1975年热板实验( hotplate) 和 1988 年的哈格里夫斯实验( Har- greaves tests)。这 4 种经典的刺激诱发痛行为学检测实验，其原理均是给予大鼠和小鼠等小动物急性伤害性刺激( noxious stimulation) ，然后观察动物的行为学反应，包括缩足或甩尾潜伏期、机械性刺激或温度刺激阈值等，从而评估动物是否出现触诱发痛( 即正常机械性刺激引起的痛觉，allo-dynia) 、机械性痛敏( 即机械性痛阈降低，mechanical hyperal- gesia) 以及热痛敏( thermal hyperalgesia) 。
大小鼠智能热板仪，型号：XR1700，上海欣软
虽然 4 种经典刺激诱发痛行为学检测已用于大鼠和小鼠动物研究多年，但是其局限性较明显: 第一，理想的镇痛药物应该在保留完整痛诱发反应的基础上特异性减轻病理性痛症状，即只减少病理性疼痛，不阻碍对有害刺激的正常反应，以保证患者服药后能在生活中避免受到伤害。但是，4 种经典实验所检测的均为实验动物对急性伤害性刺激后的行为学反应。因此，当观察到药物具有镇痛( analgesic) 效应时，其实意味着这些"镇痛" 药物可能阻断的是动物的正常保护性痛行为学反应。这也就可以解释，当这种药物应用于临床患者时，由于药物阻断了人体正常保护性痛反应，故导致患者出现脚趾触到烫的火炉甚至被烫出水泡时仍然不知道自我保护的情况。第二，当实验动物对痛刺激不反应时，除镇痛效果外，还可能有 4 种原因: 惊恐的情绪、运动动力缺乏( lack of motivation) 、麻痹运障碍、药物镇静作用 ( seda- tion) 。
由此可见，仅用痛诱发反应进行动物痛行为学检测具有很大缺陷与不足，急需可靠的行为学检测助力痛觉机制研究和镇痛策略研发。
2、8 种痛行为学检测方法的原理及优缺点
本文主要对动物痛行为学检测方法的最新研究进展做以介绍，重点介绍了 8 种痛行为学检测: 鬼脸量表( grimacescale) 、自 主 行 为( operant behavior) 、转 轮 跑 步 行 为 ( wheel running) 、挖洞行为( burrowing) 、筑巢行为( nesting) 、家庭笼监控( home cage monitoring) 、步态分析( gait analysis) 以及条件性位置偏爱/厌恶( conditioned place preference / aversion) 。每种检测方法均给出其优缺点，以帮助研究者选择最合适的 行为学检测方法。
2.1 鬼脸量表
痛苦表情被认为是人类和动物共同的表达痛苦的方式，当大鼠和小鼠遭受疼痛时会出现面部表情改变，通过对痛苦表情的评判与量化以区分痛与不痛，并对疼痛的级别给予量化。需要注意的是，判定由疼痛导致的表情改变必须同时满足存在疼痛情境的条件。鬼脸量表的使用方法多 采用视频捕获动物面部表情。表情改变主要包括: ① 面部眼眶收紧; ② 耳廓伸展变为扁平; ③ 面部肿胀; ④ 鼻根肿胀。由轻到重评分为 0 ～ 2 三档，其中 0 为不存在，2 为最明显。
由于该方法不会阻断正常保护性痛反应，因此可以用来区分动物惊恐的情绪、运动动力缺乏、麻痹运动障碍、镇静等。而且方法简单，只需摄像机和图像捕获软件即可，不需专门设备; 此外实验动物不需接受专门训练，在饲养笼里即可评估。但该方法也存在 3 个主要的缺陷，第一，疼痛持续时间与面部表情不匹配。例如，后足炎症可产生两周以上触诱发痛，但鬼脸量表评分在 2 ～ 7 d 便恢复到基线水平。此时动物虽然没有痛苦表情，但是并不意味没有经受痛苦，只是疼痛不再引起表情变化。因此，鬼脸量表仅适用于神经病理性痛的早期阶段。第二，只有显著疼痛才能得出统计学差异。第三，8% 的无痛大鼠也可见痛面部表情特征。
2.2 自主行为
人类和动物在感觉疼痛时均会发生自主行为的减少。人类表现为锻炼、工作或社交行为减少，而动物表现为摄食减少。由此可通过对摄食是否减少以及对减少程度的评判以区分痛与不痛，并实现对疼痛级别的量化。自主行为检测疼痛有一个重要的特点，即该方法在镇痛药物筛选上具有显著优势，这是因为镇痛药物不影响摄食，而镇静药物则可显著减少摄食，所以自主行为检测疼痛时保留了动物正常保护性痛反应，预防了疼痛对动物的过度伤害。
但是该方法也存在局限性，目前研究几乎全部基于颅内自主刺激( intracranial self-stimulation，ICSS) ，即将刺激电极植入大鼠内侧前脑束，再结合奖赏机制训练大鼠通过按压杆进行自我脑刺激，当大鼠反应稳定时，立即给予动物一个伤害性刺激，然后观察大鼠的摄食行为变化。所以开展此项研究者需配置 ICSS 实验室，没有该实验室则该方法不适用。此外，自主行为检测时不能区分惊恐情绪、运动动力缺乏、麻痹运动障碍、镇静等行为，这是它的另一个缺点。
2.3 转轮跑步行为
转轮跑步行为是啮齿动物的一种本能，而当动物出现后足炎症、关节炎、偏头痛样疼痛、神经病理性痛以及术后痛时，该行为表现为明显减少。由此通过对转轮跑步行为减少程度的评判可衡量药物的镇痛效应。该方法以车轮转数和跑步时间作为观察指标为，保证了数据的客观性，而且在饲养笼中即可进行跑步，排除了环境变化带来的影响。此外，有研究发现，低剂量吗啡( 1 mg /kg，此时发挥的是镇痛效应) 缓解大鼠炎性痛的同时可恢复其跑步行为，而高剂量吗啡( ＞ 3 mg /kg，此时发挥的是镇痛和镇静的综合效应) 在镇痛同时抑制跑步行为。因此，转轮跑步行为检测可在保留正常痛反应的前提下，筛选出临床有效的镇痛药物。
但是，若使用该方法检测疼痛，动物需要至少一周训练才能保证结果较为稳定，而且不能从结果中甄别出由于动机缺乏而导致的行为减少情况。另外，转轮跑步行为本身具有帮助动物从疼痛中恢复的作用，所以，不适用于长时程期进行检测。
大小鼠转轮，型号：XR-PL107，上海欣软
2.4 挖洞与筑巢行为
挖洞行为与筑巢行为是啮齿动物的本能自发行为，当动物出现病理性痛后，以上两种行为明显减少，目前这一特性已被广泛应用于实验研究中。其中，挖洞行为检测时需要预先在笼内管道中放入一定量垫料，通过测量动物从管道中取出垫料的时间和数量来评估动物的疼痛等级。筑巢行为则是通过测量动物筑巢时间和巢穴质量评估动物疼痛等级。这两种方法在饲养笼即可进行，避免了环境变化带来的影响。另外，虽然两种行为多发生于夜晚，但观察者可以在白天观察结果，还可反复放入挖洞与筑巢行为所需材料，并进行多次测试。以上优点使得该方法简便易行。此外，挖洞行为与筑巢行为保留了动物正常痛行为反应，这是其最大的优势所在。
然而，记忆等高级脑功能异常可导致筑巢和挖洞行为减少，因此该检测不能对此进行甄别。对于埃及多刺小鼠( Egypt spiny mice) 等无自然筑巢行为的物种［28］，该方法也不适用。此外，该检测方法还受多种因素影响，例如寒冷环境中群居雌鼠的筑巢行为比独居鼠更高，因此对温度等检测条件应尽可能严格设定。
下一篇我们将继续分析homecage（家庭笼监控）、步态分析仪（VisuGait动物步态分析系统，型号：XR-FP101）、条件性位置偏爱/厌恶以及用蔗糖偏爱和超声波发声进行疼痛行为学评估的实验介绍。