编译：微科盟达达兔，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。
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导读
锑矿（Sb（III））氧化（SbO）可以降低锑（Sb）的毒性以及锑（Sb）在水稻中的积累，从而在稻田Sb污染的生物修复中发挥生态作用，减少Sb在水稻中的迁移和积累。硝酸盐作为电子受体可以在缺氧环境中与SbO耦合，但是这一结论在水稻土中尚未得到研究。本研究利用稳定同位素探测（SIP）结合扩增子和宏基因组测序技术，研究了有硝酸盐依赖性的SbO在锑污染水稻土的潜在作用，并鉴定了硝酸盐依赖性Sb（III）的氧化细菌（SbOB）。厌氧SbO只出现在添加Sb(III)和NO3−的水稻土中，而仅添加Sb（III）的水稻土中未发现明显的SbO。亚砷酸氧化酶基因（aioA）丰度的增加表明，硝酸盐依赖性SbO是由携带亚砷酸氧化酶基因（aioA）的微生物催化的。经过60天的DNA-SIP培养，在添加13C-NaHCO3、Sb（III）和NO3−的处理中，aioA基因的相对丰度向DNA重组分发生明显转移，表明13C被硝酸盐依赖性SbOB结合。因此，在水稻土中鉴定出一些推测的依赖硝酸盐的SbOB，包括固氮弧菌属（Azoarcus）、固氮螺菌属（Azospira）和根瘤菌属（Chelativorans）。宏基因组分析进一步表明，硝酸盐依赖性的氧化细菌含有aioA基因以及反硝化和碳固定的相关基因，来支持它们对硝酸盐依赖的锑矿氧化（SbO）的能力。这些结果表明水稻土中存在依赖于硝酸盐的亚锑酸盐氧化）。本研究发现一些推测出的依赖硝酸盐的SbOB（固氮弧菌属（Azoarcus）、固氮螺菌属（Azospira）和根瘤菌属（Chelativorans），这增加了我们对硝酸盐依赖性氧化细菌（SbOB）多样性的认识。此外，本研究为使用DNA-SIP识别硝酸盐依赖性氧化细菌（SbOB）的概念提供了证据。
原名：Bacteria responsible for nitrate-dependent antimonite oxidation in antimony-contaminated paddy soil revealed by the combination of DNA-SIP and metagenomics
译名：DNA-SIP和宏基因组学相结合揭示锑污染水稻土中存在硝酸盐依赖性的锑矿氧化细菌
期刊：Soil Biology and Biochemistry
IF：5.795
发表时间：2021.3
通讯作者：孙蔚旻
通讯作者单位：广东省科学院生态环境与土壤研究所
在锡矿山锑矿矿区（27º44'38"N，111º27'46"E）附近采集土样，采集30-40 cm深度的不同淹水稻田土壤，样品采集后装入自封袋，冰封运回实验室。此外，还采集矿区附近受锑污染的旱地农田土壤。本研究对不同稻田和旱地稻田土壤中硝酸盐依赖性SbO进行了初步监测。水稻土均存在明显的硝酸盐依赖性SbO，而干旱土壤则没有明显的硝酸盐依赖性SbO。选择硝态氮依赖速率最快的水稻土进行进一步试验。进行三组微培养：（i）硝酸盐依赖性SbO活性培养—检验稻田中硝酸盐依赖性SbO的潜力；（ii）硝酸盐依赖性SbO富集培养—监测添加Sb（III）和NO3−后细菌群落的变化；（iii）SIP培养—通过DNA-SIP鉴定硝酸盐依赖性SbOB。 从三个不同培养时间的土壤中提取基因组DNA：硝酸盐依赖性SbO活性培养（0天、3天、6天和12天，qPCR），硝酸盐依赖性SbO富集培养（0天、12天、30天和60天，扩增测序），SIP培养（0天、30天和60天，SIP梯度分级、扩增测序和宏基因组测序）。DNA提取使用DNeasy PowerSoil DNA试剂盒（QIAGEN, Germany），并按照制造商的规定进行。在13C-NaHCO3和12C-NaHCO3的SIP培养处理中（0天、30天和60天）的DNA基因组通过等密度梯度离心分离被分成重组DNA（比如13C-DNA）和轻组DNA（比如12C-DNA）。简而言之，就是将大概2 μg的基因组DNA加入到CsCl溶液中（浮力密度（BD）=1.714 g/mL）。然后，利用Optima XPN-100型超离心机，在409000转的压力下对混合物进行24小时的超离心。用分数回收系统将得到的CsCl梯度分为24等份。利用数字折光仪测量折射率，立即测定各组分的BD值。用30%冷乙醇溶解6 μL糖原，沉淀各组分DNA，最后用30 μL TE缓冲液洗脱。从洗脱的DNA中，用qPCR来确定收集的24个片段中每个片段中aioA基因的拷贝数。用引物520f（5'-AYTGGGYDTAAAGNG-3'）/802r（5'-TACNVGGGTATCTAATCC-3'）对硝酸盐依赖性SbOB富集培养的基因组DNA进行16S rRNA部分基因扩增测序。获得的ASV特征（>0.01%）根据SILVA数据库进行分类。13CSbN三倍体培养物中aioA基因丰度最高的重组DNA部分作为一个复合DNA样本，在Illumina Hiseq 4000平台上进行宏基因组测序。此外，利用系统进化图，根据保守蛋白序列构建了系统发育树。Sb（III）氧化为Sb（V）的现象仅出现在同时添加Sb（III）和NO3−的处理中，而未出现在仅添加Sb(III)或NO3−的处理中（图1a和b）。在培养后12天，大约有0.90±0.08 mMSb（III）被完全氧化成Sb（V）（图1a和b），同时降低了NO3−（从3.00 ± 0.01 mM到0.74 ± 0.04 mM），增加了NO2−（从0.01± 0.00 mM到1.69 ± 0.22 mM）（图1c和d）。这些结果表明，水稻土厌氧SbO是依赖硝酸盐的。
图1 Sb（III）（a）向Sb（V）（b）转化，NO3−（c）向NO2−（d）转化。在培养前用热压土壤进行无菌对照。数据以均值±标准差表示（n = 3）。2 硝酸盐依赖性SbO过程中，aioA基因丰度增加在第0、3、6和12天，对所有硝酸盐依赖性SbO活性培养处理的aioA基因进行定量分析。Sb（III）和NO3−处理经过12天培养，aioA基因的拷贝数显著增加了1.4倍（P<0.05），而只添加Sb处理的aioA基因丰度没有发生变化（图2a）。此外，在Sb（III）和NO3−处理中，aioA基因拷贝数与Sb（V）浓度呈显著正相关（R=0.88，P<0.05）（图2b），但是只添加Sb处理和只添加NO3−处理没有相关性。在以上的三种处理中，编码锑氧化酶（anoA）基因的PCR产物均未获得。
图2 添加Sb（III）和NO3−处理的aioA基因丰度（平均±SE（n = 3））（a）和缺氧条件下，添加Sb（III）和NO3−处理对aioA基因拷贝数与Sb（V）浓度的相关性（b）。本研究进一步表征了两种处理（添加Sb（III）和NO3−处理和仅添加NO3−处理）的细菌群落。添加Sb（III）和NO3−处理的培养过程中，细菌群落发生明显的变化（0天、12天、30天和60天）（图3）。添加Sb（III）和NO3−处理使固氮弧菌属（Azoarcus）的相对丰度显著增加，从第0天的检测不出结果到第60天的78±2%（P<0.05）（图3）。添加Sb（III）和NO3−处理中与固氮螺菌属（Azospira）相关的细菌比例在第30天达到峰值（42±6%），然后在第60天降低到5±2%（P<0.05）（图3）。相比之下，仅添加NO3−处理的细菌群落相对稳定，草螺菌属（Herbaspirillum）相对丰度从第0天的检测不出结果到第60天的10±2%，芽单胞菌（Gemmatimonas）从第0天的4±0%到第60天的9±1%（图3）。
图3 在富集培养过程中添加Sb（III）和NO3−处理数据对细菌群落组成的影响。以三次平均值表示（标准差在文中列出）。DNA-SIP技术已被广泛用于将微生物功能与特征相联系，而且在生物过程中可以监测有效微生物群。在本研究中，硝酸盐依赖性SbO的微生物会将13C标记的底物结合到生物量中（比如13C-NaHCO3）。在SIP培养中，12CSbN的轻组分（BD = 1.708 g/mL）中检测到aioA基因丰度最大（图4）。和12CSbN相比，13CSbN处理中，aioA基因丰度最高的部分逐渐转移到重组部分（第30天，BD=1.712；第60天BD=1.727 g/mL），说明硝酸盐依赖性SbOB在培养过程中与13C结合。 如图5a所示，13CSbN处理重组DNA以固氮弧菌属（Azoarcus）（45±6%）菌为主，其次为芽单胞菌（Gemmatimonas）（18±4%）、盐单胞菌（Halomonas）（4±1%）和根瘤菌属（Chelativorans）（2±0%）。应注意的是芽单胞菌（Gemmatimonas）（9±2%）也是13CN处理重组分中数量最多的属（图5a）。此外，用线性判别分析 (LEfSe)分析发现，13CSbN和13CN处理下有19个属的DNA重组分丰度存在显著差异（P < 0.05； LDA 分数> 2.0）（图5b）。
图4 SIP试验第0、30和60天采集的13/12CSbN和13/12CN处理组分中aioA基因的相对丰度。 L1-L3为12CSbN处理中aioA基因最多的典型轻组分，H1-H3和H4-H6分别为13CSbN和13CN处理中aioA基因最多的典型重组分。垂直误差线表示aioA基因相对丰度的标准误差，水平误差线表示组分浮力密度的标准误差（n = 3）。
图5 SIP试验第60天，13CSbN和13CN处理DNA重组部分和12CSbN处理DNA轻组部分细菌群落组成以数量最多的属（前25）。各属的相对丰度用气泡图表示（a）。每个气泡代表一种培养物的代表性分数，对每种处理的三次培养物进行测序。线性判别分析效应 (LEFSe)显示，13CSbN处理和13CN处理重组分差异较大（b）。这些片段（bins）的遗传注释表明，大部分片段（bins）有aioA基因，而aioB基因只在部分片段（bins）中被观察到（索氏菌属（Thauera）相关的bin4，芽单胞菌（Gemmatimonas）相关的bin14）（图6）。无论是在组装片段（bins）中还是在原始的宏基因组数据集中，都没有检测到anoA基因。研究人员还研究了KEGG数据库中与反硝化和碳固定有关的基因。硝酸盐还原基因（narGHIVYZ、napAB和nxrAB）在所有片段（bins）中含量最高，其次为NO2−还原基因（nirKS）和NO 还原基因（norBC）（图6）。此外，参与rTCA和DC/4-HB循环的基因比参与其它通路的基因更为丰富（图6），表明推测的SbOB主要通过rTCA和DC/4-HB循环与碳进行反应。图6 在SIP试验第60天13CSbN处理中DNA重组片段的宏基因组测序，检测负责Sb（III）氧化、反硝化和碳固定的基因计数。依据KEGG数据库的信息对反硝化和碳固定的基因统计。硝酸盐还原基因：narGHIVYZ、napAB、nxrAB；亚硝酸盐还原：nirKS；没有还原：norBC；一氧化二氮还原；nosZ。对于碳固定途径，有107个基因被编号，这里没有列出。详情请参阅KEGG数据库。红色、蓝色和绿色热图分别表示As（III）/Sb（III）氧化、反硝化和碳固定相关基因的分布。数字代表基因的数量。颜色越深表明基因的丰度越高。（本图例中颜色引用的解释，读者可参考本文网页版本）。水稻是锑暴露的主要途径，特别是在矿区，Sb（III）时比Sb（V）有效性高。SbO产生的Sb（V）流动性较弱，从而减少水稻对Sb的吸收。因此，SbO可能有利于减轻水稻土的Sb污染的影响。水稻土中缺氧条件和高浓度硝酸盐可能会促进硝酸盐依赖性SbO的发生。本研究的初期培养表明，在所有接种Sb污染水稻土的设施中都出现了硝酸盐依赖性的SbO，而在接种干旱土壤的设施中则没有出现硝酸盐依赖性的SbO。这些观测结果表明，水稻土特殊的地球化学条件（如缺氧环境、高浓度Sb和硝酸盐）可能使依赖硝酸盐的SbOB富集，从而促进依赖硝酸盐的SbO。 本研究已经证明，厌氧水稻栽培中添加Sb（III）和NO3−处理的厌氧Sb(III)氧化为Sb(V)，但仅添加了NO3−处理或Sb（III）处理的栽培中，厌氧Sb(III)没有氧化为Sb(V)（图1），这说明硝酸盐的加入可促进SbO的发生。与只添加NO3−处理相比，添加Sb（III）和NO3−处理有NO2−积累。这一发现证实了细菌可以介导水稻土中依赖硝酸盐的SbO。由于Sb和As具有相似的化学性质，所以有人认为微生物可能通过与As相似的代谢途径驱动Sb转化。之前的一些研究表明，亚砷酸氧化酶（由aioA基因编码）可能与SbO有关。本研究的一些观察结果也表明aioA基因参与厌氧SbO：（i）仅在硝酸盐依赖的SbO培养过程中，aioA基因拷贝数增加。（ii）经过60天的培养，仅在13CSbN处理中，aioA基因的相对丰度最高，并逐渐向DNA重组分转移，而在其它处理中（即13CSbN、13CN和12CN），未发现明显的向DNA重组分转移。3 DNA-SIP鉴定出推测的硝酸盐依赖性SbOB在本研究中，许多属，如固氮弧菌属（Azoarcus）、固氮螺菌属（Azospira）和根瘤菌属（Chelativorans），被认为是依赖硝酸盐的SbOB。在添加Sb（III）和NO3−处理中，固氮弧菌属（Azoarcus）的相对丰度从检测不出到第60天时相对丰度增加至78%（图3）。此外，从DNA-SIP数据可以看出（图5），在13CSbN处理的DNA重组部分，固氮弧菌属（Azoarcus）占主导地位（接近50%），但在13CN处理中没有发现，这表明固氮弧菌属（Azoarcus）只在硝酸盐依赖的SbO过程中吸收了13C-NaHCO3。在13C-DNA重组分宏基因组中检测到含有aioA基因的与固氮弧菌属（Azoarcus）相关的片段（bin）（图6）。本研究中，根瘤菌属（Chelativorans）被认定为依赖硝酸盐的SbOB，有两个原因：（i）它们在13CSbN处理的重组分比13CN处理的重组分富集显著（图5）；根瘤菌属（Chelativorans）相关的bin中有aioAB基因和反硝化基因。13C-重组DNA组分宏基因组库中的宏基因组片段为研究硝酸盐依赖性的SbOB群落的生理特性提供了另一种方法。与这些属有关的片段内存在aioA基因及其反硝化和固碳基因（图6），这表明它们有可能产生依赖硝酸盐的SbO。在13CSbN和13CN的DNA重组分中芽单胞菌（Gemmatimonas）的丰度均高于DNA轻组分。在与芽单胞菌（Gemmatimonas）相关的片段中，既没有检测到aioA，也没有检测到aioB，却检测到了反硝化和碳固定相关的基因。如果要揭示它们在硝酸盐依赖性SbO中的作用则需要进一步的研究来证明。本研究为使用DNA-SIP识别依赖硝酸盐的SbOB提供理论依据。在长期培养条件下（60天），才能观察到结合13C的微生物群落发生了明显的变化。由于Sb（III）比Sb（V）更容易被水稻吸收，所以水稻中Sb（III）的氧化可以减少水稻对Sb的吸收，从而对环境和健康有好处。目前的研究表明：（i）依赖硝酸盐的SbO可以发生而且通过水稻土本身的微生物群落就可以进行；（ii）aioA可能是导致硝酸盐依赖性SbO的关键基因；（iii）通过DNA-SIP鉴定出了一些新的依赖硝酸盐的SbOB，包括固氮弧菌属（Azoarcus）、固氮螺菌属（Azospira）和根瘤菌属（Chelativorans）相关的细菌。
锑（Sb）是一种有毒的非金属，在周期表中属于第15族，和砷有相似的化学性质。Sb的迁移率、生物利用率和毒性取决于它的氧化态，例如Sb（V）的毒性小于Sb（III）和Sb（III）的氧化态（SbO）。SbO可能是一个重要的生物地球化学过程，它会降低水稻中Sb的毒性、减少Sb在水稻中的迁移和积累。水稻土在缺氧和高浓度硝态氮的条件下容易发生硝态氮依赖的SbO反应，但是目前尚未有相关报道。所以本研究在结合DNA-SIP与宏基因组研究的基础上，主要研究硝酸盐依赖性的SbO在锑污染的水稻土上的潜力，鉴定代表硝酸盐依赖性的SbO细菌，并且探索推测的硝酸盐依赖性SbOB的代谢潜能。
