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Transcriptional insights into the CD8+ T cell response in mono-HIV and HCV infection
HIV或HCV单独感染中CD8+T细胞免疫应答的转录水平研究
一、研究背景
人类免疫缺陷病毒（HIV）和丙型肝炎病毒（HCV）均属高度易变、复制快速的RNA病毒，能在人体内建立长期慢性致病性感染。在没有接受治疗的情况下，HIV或HCV单独感染者的疾病进程具有显著差异。然而，有一小部分HIV感染患者能维持病情长期稳定，包括长期不进展者（LTNPs）和精英控制者（ECs）；少数HCV感染患者可发生自发性病毒清除（称为HCV自发清除者）。由于HIV-HCV合并感染较为常见，了解CD8+T细胞在HIV或HCV单独感染中转录水平上的相似性，有助于提高抗病毒治疗的疗效。因此，作者在疾病不同的进展阶段对HIV或HCV单独感染者的CD8+T细胞基因表达谱进行了荟萃分析及生物信息学分析。
二、分析流程
三、结果解读
1. 筛选差异表达基因（DEGs）
在GEO数据库中获取相关表达谱芯片数据。其中，GSE6740和GSE49954的分组为HIV/HCV慢性感染者vs健康对照者。GSE24081、GSE6740、GSE93711和GSE93712的分组为HIV长期不进展者/HCV自发清除者vs相应慢性感染者（表1）。
表1.相关芯片数据集概览
在HIV/HCV慢性感染组vs健康对照组中，作者使用limma包进行差异表达分析，并以|log2 fold change (FC)|≥1.5 或 P＜0.05为筛选条件。在HIV慢性感染组vs健康对照组中，共筛选出625个DEGs（136个上调，489个下调）。在HCV慢性感染组vs健康对照组中，共筛选出154个DEGs（56个上调，98个下调）。图1显示了相应热图。
图1.HIV/HCV慢性感染组vs健康对照组的DEGs热图
在HIV长期不进展组/HCV自发清除组vs相应慢性感染组中，作者使用表达谱数据分析在线工具INMEX进行差异表达分析，并以Fisher's combined p value＜0.10为筛选条件。在HIV长期不进展组vs慢性感染组中，共筛选出92个DEGs（47个上调，45个下调）。在HCV自发清除组vs慢性感染组中，共筛选出50个DEGs（13个上调，37个下调）。
2. GO和KEGG富集分析
作者使用DAVID软件进行GO和KEGG富集分析，以P＜0.05作为标准。
在HIV/HCV慢性感染组vs健康对照组中，GO分析显示HIV和HCV的DEGs共同参与了免疫应答、炎症反应、正向调节NF-κB活动等生物过程（图2a、图2b）。KEGG通路富集分析显示，HIV和HCV的上调基因均在NF-κB信号通路、细胞因子和细胞因子受体相互作用信号通路富集（图2c、图2d）
图2.HIV/HCV慢性感染组vs健康对照组的GO和KEGG分析图
在HIV长期不进展组/HCV自发清除组vs相应慢性感染组中，KEGG通路富集分析显示，HIV和HCV有7个相同通路富集（图3a、图3b）。由于细胞周期与病毒感染期间的CD8+T细胞的功能有关，作者对此进行了GO分析。图3c显示，在HIV长期不进展组vs相应慢性感染组中，7个与有丝分裂密切相关的基因中，2个上调，5个下调。作者认为下调基因数量占优势可能提示了有丝分裂减缓。在HCV自发清除组vs相应慢性感染组中，在有丝分裂进程中起到负向调控转录活动的RBL2上调，提示可能与细胞分裂的抑制有关。同时，与细胞凋亡有关的基因STAT5A、MTCH1下调。综上作者推断HIV长期不进展者/HCV自发清除者的病程得到控制可能与CD8+T细胞存活数的提升有关，这借由有丝分裂细胞周期减缓和细胞凋亡减少实现。
图3.HIV长期不进展组/HCV自发清除组vs相应慢性感染组的KEGG和GO分析图
3. PPI网络构建
作者利用STRING数据库预测DEGs的相互作用关系（confidence score＞0.4），随后利用Cytoscape工具对PPI网络进行可视化。
在HIV/HCV慢性感染组vs健康对照组中，HIV-DEGs的PPI网络中共包含542个节点，根据degree值进行排序仅显示排名前100的节点（图4a）。作者发现degree值排序前100的节点中，多数与干扰素刺激基因（ISGs）的上调有关。HCV-DEGs的PPI网络中共包含92个节点（图4b），degree值排序靠前的CXCL8、TLR2、FPR1均与ISGs的上调有关。图4c的Venn图显示两者间有17个共有DEGs。GO分析显示这17个DEGs主要参与细胞防御反应。
图4.HIV/HCV慢性感染组vs健康对照组DEGs的PPI网络及Venn图
在HIV长期不进展组/HCV自发清除组vs相应慢性感染组中，HIV-DEGs的PPI网络中（图5a）作者发现其中10个节点与ISGs的下调有关，包括GBP1、MX1、IRF9、EIF2AK2、IFIT3等。HCV-DEGs的PPI网络中（图5b）作者同样发现degree值最高的三个节点与ISGs的下调有关，包括EP300、STAT5A、PPP2CA。
图5.HIV长期不进展组/HCV自发清除组vs相应慢性感染组DEGs的PPI网络
4. miRNA预测
作者使用mirDIP和miRDB数据库预测可同时作用于HIV和HCV的miRNA。作者选取了HIV长期不进展组vs相应慢性感染组中，与ISGs的下调有关的IFIT3；HCV自发清除组vs相应慢性感染组中同样与ISGs的下调有关的STAT5A，两者均具有较高的degree值。在靶向作用于IFIT3的9个候选miRNA和靶向作用于STAT5A的16个候选miRNA中，作者发现miRNA-143-3p是两者候选miRNA的交集。相关报道显示ERK5是miRNA-143的靶基因，且在原代人内皮细胞和单核细胞中起促炎作用。因此作者推断miRNA-143-3p可能通过抑制ERK5发挥其抗炎作用。在附加材料中，作者通过细胞转染和PCR技术发现miRNA-143-3p的过表达可抑制原代CD8+T细胞ERK5的表达（图6），提示miRNA-143-3p对ERK5具有负向调节作用。
图6.miRNA-143-3p下调ERK5表达
小结
作者挖掘GEO数据库中HIV和HCV相关表达谱芯片数据，分析差异表达基因后，通过DAVID工具进行GO分析和KEGG通路富集分析预测靶基因功能和相关通路，利用STRING平台及Cytoscape软件构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，最终筛选出与疾病进展密切相关的miRNA-143-3p。最后作者提交了补充材料，通过细胞转染和PCR技术发现miRNA-143-3p的过表达可抑制原代CD8+T细胞ERK5的表达，进一步证明miRNA-143-3p对ERK5具有负向调节作用。